Pochodzenie siły elektroforetycznej na DNA w nanoporach półprzewodnikowych

Powodowany napięciem transport makrocząsteczek przez biologiczne6,7 i sztuczne8,9,10,11,12 nanopory stanowi idealny system do badania fizyki procesu translokacji13. Migracja elektroforetyczna jest główną siłą napędową translokacji DNA przez nanopory i jest konsekwencją siły wywieranej przez zewnętrznie przyłożone pole elektryczne na ładunki w łańcuchu polielektrolitu. Ponieważ DNA w roztworze jest naładowany ujemnie, jest on ekranowany przez warstwę mniej lub bardziej mobilnych, dodatnio naładowanych przeciwjonów, które również podlegają działaniu pola elektrycznego. Od dawna wiadomo, że siła wywierana na przeciwjonach wywołuje hydrodynamiczną siłę oporu na DNA, która lokalnie równoważy siłę elektryczną, prowadząc do znacznie wolniejszej migracji niż można by się spodziewać na podstawie samego oporu Stokesa (patrz, na przykład, ref. 1). Elektroforetyczna translokacja polimeru przez mały por podlega podobnym zasadom, ale tutaj geometria porów (lub lokalna struktura żelu) ma głęboko wpływać na profil przepływu hydrodynamicznego wokół DNA, a tym samym na siłę oporu przeciwstawiającą się ruchowi1,5,14. Pomimo coraz bardziej wyrafinowanych eksperymentów3,12,15,16, nie odnotowano jeszcze jednoznacznej manifestacji oddziaływań hydrodynamicznych w translokacji DNA. Tutaj zajmujemy się tym problemem, wykorzystując nasze niedawno opracowane urządzenie łączące nanopory półprzewodnikowe z pincetami optycznymi3 do zatrzymania translokacji DNA, a następnie pomiaru siły przeciągania na pojedynczej nici DNA (patrz sekcja Metody). Schemat aparatury pomiarowej przedstawiono na Rys. 1a.

a, Schemat aparatury pomiarowej. Za pomocą pęsety optycznej, translokacja DNA jest zatrzymywana i mierzona jest siła działająca na DNA. Jednocześnie mierzone jest przewodnictwo jonowe nanoporu. b, Cylindryczny model DNA w nanoporze. Niebieskie strzałki po obu stronach DNA schematycznie przedstawiają prędkość poruszającego się płynu w wyniku elektroosmozy.

W przeciwieństwie do eksperymentu z elektroforezą żelową, pole elektryczne w eksperymencie z nanoporami jest ograniczone do bezpośredniego sąsiedztwa porów, a siły elektryczne działają lokalnie na krótki odcinek DNA. Natężenie pola elektrycznego w porach osiąga zwykle ∼106 V m-1 dzięki bardzo cienkim (∼60 nm), wolnostojącym membranom. Duża długość przetrwania λ-DNA, wynosząca około 50 nm, zapewnia, że odcinek DNA wewnątrz porów jest praktycznie w pełni rozciągnięty. Sytuacja ta jest przedstawiona schematycznie na Rys. 1b, gdzie L i R oznaczają długość i promień porów, a ΔV jest przyłożonym potencjałem. DNA posiada gęstość ładunku liniowego λbare=-0.96 nC m-1 (2 elektrony na parę zasad) i jest tutaj modelowane jako jednolicie naładowany cylinder o promieniu a=1.1 nm. Siła elektrostatyczna działająca na szkielet DNA jest reprezentowana przez Fbare=λbareΔV (ref. 3). Przeciwstawia się jej siła oporu Fdrag wywołana przez elektroforetyczny ruch przeciwjonów w przeciwnym kierunku: Fdrag jest więc nieodłącznym elementem procesu translokacji, który ostatecznie można również prześledzić na przykładzie sił elektrycznych5. Wynikająca z tego siła netto jest siłą elektroforetyczną napędzającą translokację, daną przez Felec=Fbare-Fdrag. W naszym przypadku, Felec jest równoważona przez przeciwstawną siłę mechaniczną Fmech=-Felec z pęsety optycznej, która zatrzymuje DNA wewnątrz porów.

Pochodzenie Fdrag leży w przestrzennym rozkładzie jonów i odpowiadającym im profilu przepływu płynu. Opis pola średniego rozkładów jonów jest podany przez formalizm Poissona-Boltzmanna, w którym potencjał elektrostatyczny jest dany przez , a odpowiadające mu rozkłady jonów jako . Tutaj, λD jest długością Debye’a, jest zredukowanym potencjałem elektrostatycznym, e jest ładunkiem elementarnym, Φ jest potencjałem, kB jest stałą Boltzmanna, T jest temperaturą, n jest gęstością liczbową jonów, a z jest walencyjnością gatunku jonowego. Rysunek 2a przedstawia obliczone potencjały dla dwóch rozmiarów porów otrzymane przez numeryczną ocenę równania Poissona-Boltzmanna w geometrii cylindrycznej (patrz rozdział Metody). Odpowiadające im rozkłady jonów pokazane są na Rys. 2b. Warstwa Debye’a DNA charakteryzuje się zubożeniem w koiony, podczas gdy przeciwjonów jest bardzo dużo ze względu na duży ładunek DNA. Ponieważ rozkłady te są rozwiązaniami pełnego (nieliniowego) równania Poissona-Boltzmanna, uwzględniony jest efekt kondensacji Manninga17.

a, Zredukowany potencjał elektrostatyczny dla „dużego” porów (zielony, R=10 nm) i „małego” porów (niebieski, R=3 nm). Szara linia wskazuje położenie ściany porów dla małych porów. Stężenie soli wynosi cbulk=20 mM (λD=2.2 nm), a ścianki porów dla uproszczenia przyjęto jako nienaładowane w tych obliczeniach. b, Odpowiadające rozkłady jonów. W „dużych” porach (R≫λD), dystrybucja jonów wokół DNA nie jest znacząco zaburzona przez ścianki porów, na co wskazuje obserwacja, że zielone krzywe osiągają wartość objętościową. Jednak w „małych” porach (R≲λD), chmura przeciwjonów (krzywe ciągłe) jest ściskana przez ścianę porów i por może zostać pozbawiony koionów (krzywe przerywane), pozostawiając głównie przeciwjonów dodatnich równoważących ujemne ładunki na DNA. Przykładem tej sytuacji są krzywe niebieskie. c, Profile prędkości płynu obliczone przez połączenie wyników z a i b z równaniem Stokesa. d, Znormalizowana całka powierzchniowa naprężenia ścinającego w każdej pozycji r, obliczona jako , gdzie τ jest naprężeniem ścinającym w płynie. Na powierzchni DNA, . e, Obliczone zredukowane potencjały powierzchniowe dla DNA (czerwony) i ścianki nanoporu (szary) jako funkcja promienia porów. Szary obszar jakościowo przedstawia region „małych porów”, w którym rozkłady jonów są pod wpływem ograniczenia nanoporu.

W naszym eksperymencie przeciągania DNA, rozkład przeciwjonów w dużym stopniu określa profil prędkości indukowanego przepływu elektroosmotycznego. Profil prędkości przepływu może być obliczony przez rozwiązanie równania Stokesa , gdzie η jest lepkością dynamiczną płynu, vz jest prędkością płynu, Ez jest przyłożonym polem elektrycznym, a ρ(r) jest rozkładem ładunku jonowego. Obliczone profile przepływu płynu przedstawiono na Rys. 2c. Następnie, w celu powiązania profilu przepływu z oporem lepkim, naprężenie ścinające w płynie jest obliczane jako τ(r)=-η(dvz/dr). Rysunek 2d przedstawia , który jest równy stosunkowi Fdrag/Fbare, gdy jest oceniany na powierzchni DNA (r=a). Wynika z niego, że Fdrag jest tego samego rzędu wielkości co siła elektrostatyczna działająca na DNA, której się przeciwstawia. Fdrag jest większa dla większych porów, co odpowiada mniejszej sile przeciągania.

Dla porównania z naszymi eksperymentami, wygodnie jest wyrazić powyższy model w formie, która bezpośrednio odnosi siłę elektroforetyczną do właściwości nanoporu. Jak pokazano wcześniej5, równania Poissona-Boltzmanna i Stokesa mogą być połączone, aby otrzymać wyrażenie na siłę elektroforetyczną na nieruchomej cząsteczce,

Φ(a) i Φ(R) są potencjałami powierzchniowymi odpowiednio DNA i nanoporu, a ε jest stałą dielektryczną wody. i wydedukowane z równania Poissona-Boltzmanna są wykreślone na Rys. 2e w funkcji R. W dużych porach potencjały powierzchniowe są niezależne od R. Równanie (1) przewiduje więc, że mierzona siła Fmech ma prostą zależność ln-1(R/a) od wielkości porów. Z kolei w mniejszych porach warstwa Debye’a jest ściskana przez ściankę porów (Rys. 2). Powoduje to zależność potencjałów powierzchniowych od wielkości porów i odpowiednio bardziej skomplikowaną zależność Fmech od R.

Sposobem na bezpośrednie przetestowanie powyższego modelu jest pomiar siły przeciągania DNA Fmech w funkcji promienia porów R. Ponieważ jednak wcześniejsze prace koncentrowały się na mniejszych porach, najpierw demonstrujemy, że możliwe jest wykrycie obecności pojedynczej cząsteczki DNA w bardzo dużych (R≫a) nanoporach. Detekcja DNA w porach opiera się na pomiarze stopnia przewodnictwa jonowego ΔG, kiedy DNA wchodzi do porów. Wykazano wcześniej, że ΔG jest spowodowane konkurencją pomiędzy dwoma czynnikami: wykluczeniem objętościowym, obniżającym liczbę jonów dostępnych dla przewodnictwa, oraz nadmiarem kontrjonów DNA, efektywnie zwiększającym liczbę jonów dostępnych dla przewodnictwa12. To, który z tych dwóch efektów dominuje, zależy od stężenia elektrolitu w masie, powodując, że ΔG jest dodatnie (wzrost przewodnictwa) w obecnych eksperymentach z 20-50 mM soli. Przewiduje się, że w tych zoptymalizowanych warunkach solnych, stosunek sygnału do szumu wychwytu DNA będzie wysoki nawet w bardzo dużych porach18. Typowy krok w prądzie wraz z odpowiadającą mu zmianą pozycji Z koralika pokazany jest na Rys. 3a. Obserwujemy wyraźny skok prądu, mimo że DNA zmienia konduktancję nanoporu o mniej niż 1%. Typowy histogram zdarzeń wychwytu pokazany jest na Rys. 3b. Dane te pokazują, że jesteśmy w stanie w sposób kontrolowany wprowadzać i wykrywać pojedyncze cząsteczki nawet w nanoporach o R=45 nm, gdzie DNA pokrywa tylko 1/2000 powierzchni przekroju nanoporu.

a, Typowy przykład prądu porów I (górny panel, czerwony uśredniony) i pozycji koralika Z (dolny panel) podczas wychwytywania DNA w porach R=39 nm w 33 mM KCl przy 80 mV. Pomiary prądu były filtrowane dolnoprzepustowo przy 1 kHz. b, Histogram ΔG 88 wychwytów DNA w nanoporze w tych samych warunkach jak w a. c, ΔG w porach o różnych promieniach. Zdarzenia wychwytu następowały zwykle przy napięciach 60-100 mV. Pozioma przerywana linia jest wskazówką dla oka. Trójkąty: 20 mM KCl, gwiazdki: 33 mM KCl, diamenty: 50 mM KCl, zielona gwiazda: dane z b, słupki błędów: odchylenie standardowe oszacowane na podstawie histogramów ΔG. Symbole otwarte reprezentują dane z eksperymentów swobodnej translokacji bez pęsety optycznej.

Wyznaczone doświadczalnie wartości ΔG w funkcji promienia nanoporu przedstawiono na Rys. 3c dla 10 nanoporów o promieniach od R=3 do 45 nm. Szary obszar wskazuje region „małych porów”, w którym, zgodnie z obliczeniami z Rys. 2b, na rozkład jonów w pobliżu DNA wpływa obecność ścianki nanoporu. Z symulacji wynika, że w dużych nanoporach ΔG jest w przybliżeniu stałe. Większe ΔG w małych nanoporach jest zgodne z kompresją dyfuzyjnej warstwy ekranującej, zapewniającej neutralność ładunku w porach. Bardziej ilościowe porównanie zmierzonego ΔG z teorią jest jednak trudne: opór dostępu Racc staje się coraz ważniejszym wkładem do całkowitego oporu układu w dużych porach19, a obecnie nie wiadomo, jak obecność nici DNA przewleczonej przez por wpływa na Racc.

Po ustaleniu możliwości zatrzymywania i wykrywania cząsteczek DNA zarówno w dużych, jak i małych porach, przechodzimy teraz do głównego wyniku tego listu, a mianowicie eksperymentalnie wyznaczonej wielkości siły przeciągania Fmech w funkcji promienia nanoporu R. Rysunek 4a przedstawia Fmech w funkcji przyłożonego napięcia ΔV w nanoporach o R=4 nm (lewy panel) i R=39 nm (prawy panel). Zależność ta jest w przybliżeniu liniowa w obu przypadkach. Jednakże, Fmech/ΔV w małym porcie jest dwukrotnie większy niż w dużym. Rysunek 4b przedstawia stosunek Fmech/ΔV jako funkcję wielkości porów: Fmech/ΔV maleje stopniowo wraz ze wzrostem rozmiaru, zgodnie z oczekiwaniami na podstawie równania (1). Krzywa przerywana wynika z połączenia potencjałów powierzchniowych dla pełnego ładunku DNA (Rys. 2e) z równaniem (1), bez żadnych dodatkowych korekt. Pomimo uproszczeń nieodłącznie związanych z modelem jednowymiarowym, wynik teoretyczny dość dobrze oddaje trend w danych, chociaż ilościowo przeszacowuje siłę przeciągnięcia o ∼50%. Różnica ta może być przypisana (kombinacji) kilku czynników, w tym zmniejszeniu ruchliwości przeciwjonów na powierzchni DNA12,20 lub dodatkowemu przeciwstawnemu elektroosmotycznemu przepływowi płynu wynikającemu ze stałych ładunków na powierzchni nanoporu5. W ujęciu równania (1), oba efekty mogą być reprezentowane przez obniżenie wielkości różnicy potencjałów powierzchniowych ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), zmniejszając tym samym wielkość Fmech. Empiryczne zmniejszenie ΔΦ o 33% daje w wyniku krzywą stałą na Rys. 4b, doskonałe dopasowanie do danych eksperymentalnych. Ta redukcja ΔΦ jest równoważna około 50% gołego ładunku DNA ekranowanego przez jony, które są efektywnie unieruchomione na jego powierzchni (jak pokazano na Suplementarnym Rys. S1) lub obecności ładunku powierzchniowego 15 mC m-2 na ścianie porów (Suplementarny Rys. S2). Chociaż nasz eksperyment nie może bezpośrednio rozróżnić tych dwóch mechanizmów, wnioskowana gęstość ładunku powierzchniowego jest typowa dla powierzchni SiO221. Sugeruje to, że gęstość ładunku powierzchniowego w naszych nanoporach nie jest silnie uzależniona od procesu wytwarzania i że ładunek w porach jest odpowiedzialny za znaczną część obserwowanej korekcji.

a, Pomiary siły przeciągania w funkcji przyłożonego potencjału w małym (lewy panel) i dużym nanoporze (prawy panel). W każdym przypadku pokazane są dwa pomiary uzyskane przy różnych odległościach pomiędzy koralikiem a nanoporem. b, Zmierzona siła w funkcji promienia porów. Niebieskie i zielone symbole odpowiadają danym w a. Dane dla obszaru małych porów pochodzą z ref. 3. Krzywe reprezentują wynik teoretyczny dla gołego ładunku DNA (krzywa przerywana) i dla zredukowanego ΔΦ (linia ciągła, patrz tekst). Wstawka pokazuje schematycznie jak siła na kontriony DNA jest dzielona pomiędzy DNA i ścianki porów poprzez opór lepki w małym i dużym porcie; żółta strzałka reprezentuje gołą siłę elektrostatyczną działającą na DNA. Trójkąty: 20 mM KCl, gwiazdki: 33 mM KCl, diamenty: 50 mM KCl. Słupki błędów wynikają z niepewności kalibracji pułapki optycznej, które są szacowane na 10-30% skalibrowanej sztywności pułapki.

Czynniki zewnętrzne nie uwzględnione w naszym prostym modelu mogą również wpływać na wartość bezwzględną siły przeciągania. Na przykład, może to być spowodowane siłami elektrostatycznymi i/lub hydrodynamicznymi na koraliku lub na części DNA znajdującej się w polu elektrycznym tuż poza nanoporem. Jednak nasze eksperymenty nie wykazują żadnych dowodów na takie efekty, ponieważ nie wykryliśmy żadnych zmian w sile przeciągania, gdy koralik był umieszczony w coraz większej odległości od nanoporu3. Ponadto, eksperymentalne krzywe siła-napięcie są liniowe w naszym zakresie napięcia (Rys. 4a), wskazując, że siły entropowe są małe w porównaniu z siłami elektrostatycznymi, co jest zgodne z niezależnymi pomiarami sił entropowych w rozciąganiu DNA22.

Zależność zmierzonej siły od promienia porów na Rys. 4b bezpośrednio pokazuje, że siła elektroforetyczna w translokacji DNA jest częściowo zdeterminowana przez hydrodynamiczne sprzężenie między przeciwjonami DNA a ścianą nanoporu. Geometria nanoporu determinuje wielkość siły oporu wywieranej na DNA przez te przeciwjonów. Sprzężenie to ma ważne konsekwencje dla interpretacji eksperymentalnie wyznaczonych sił, ponieważ siły te nie są w oczywisty sposób zdeterminowane przez wewnętrzne właściwości samego DNA1,23.

Zmian siły można również oczekiwać wraz ze wzrostem stężenia soli, ponieważ zmienia to długość Debye’a, a tym samym zarówno potencjał powierzchniowy DNA, jak i przypuszczalnie siłę przeciągnięcia Fmech. To oczekiwanie jest jednak skomplikowane przez fakt, że gęstość ładunku powierzchniowego porów również zmienia się znacznie ze stężeniem soli12 i że teoria średniego pola używana tutaj staje się niewiarygodna przy wysokiej sile jonowej. W poprzednich eksperymentach, Fmech w rzeczywistości okazał się niezależny od stężenia soli aż do 1 M (ref. 3), a interpretacja tych danych oparta na modelu, w którym Φ(R) zależy od stężenia soli została zaproponowana przez Ghosala5.

W swobodnej translokacji DNA, siła przywracająca Fmech jest nieobecna i efektywnie zastąpiona przez dodatkowy opór Stokesa FStokes proporcjonalny do prędkości cząsteczki. Cz±steczka przemieszcza się ze stał± prędko¶ci±, a siła elektroforetyczna jest równoważona przez FStokes. Zależność pomiędzy siłą przeciągania Fmech, mierzoną za pomocą pęsety optycznej, a prędkością translokacji vtrans, wyznaczoną na podstawie eksperymentów translokacji wolnego DNA, jest dana4,5,14

Wynik ten jest równoważny oporowi Stokesa, którego doświadczyłby nienaładowany cylinder translokujący przez cylindryczny por ze stałą prędkością vtrans. Zatem Fmech i vtrans są wielkościami proporcjonalnymi, powiązanymi przez czynnik zależny od geometrii. To oczekiwanie jest jakościowo potwierdzone przez dane doświadczalne3,12, które pokazują, że Fmech i vtrans są rzeczywiście w przybliżeniu proporcjonalne. Obliczaj±c vtrans jako długo¶ć konturu λ-DNA podzielon± przez wyznaczony eksperymentalnie czas translokacji otrzymujemy vtrans=(16 μm/1.1 ms)≈15 mm s-1, co daje Fmech/vtrans=1,750 pN s m-1 (dane dla porów o promieniu 5-nm). Równanie (2) daje jednak wartość 249 pN s m-1 dla tego współczynnika, przy zastosowaniu η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm i a=1.1 nm. Jest to wartość siedmiokrotnie mniejsza od uzyskanej doświadczalnie. Translokacja DNA przez te pory zachodzi więc ze znacznie mniejszą prędkością niż można się spodziewać na podstawie sił elektroforetycznych zmierzonych za pomocą pęsety optycznej i opisu pola średniego. Ponieważ we wszystkich tych eksperymentach użyto podobnych nanoporów, wniosek ten wskazuje na bardziej fundamentaln± różnicę pomiędzy sytuacj± statyczn± nieruchomej cz±steczki a sytuacj± dynamiczn± translokacji. W swobodnej translokacji DNA, konformacja DNA poza porem powoduje dodatkowy opór na poruszającej się cząsteczce24, co może tłumaczyć tę rozbieżność.

Podsumowując, wykazaliśmy, że siła elektroforetyczna na cząsteczce DNA w nanoporze zależy od geometrii porów. Nie jest to oczekiwane na podstawie prostej elektrostatyki, ale może być prosto zrozumiane poprzez rozważenie oporu hydrodynamicznego indukowanego przez przeciwciała ekranujące DNA w roztworze. Obliczenia numeryczne oparte na równaniach pola średniego dają dobry opis zależności mierzonych sił od wielkości porów.