Wat, waarom en hoe van explantatiecultuur

Wat is explantatiecultuur en waarom zou ik het gebruiken?

Explantatiecultuur is de cultuur van kleine stukjes weefsel die chirurgisch uit dierlijk weefsel of orgaan zijn verwijderd. Het is een nuttige methode om verschillende redenen.

1. Het behoud van de histotypische architectuur en biochemische eigenschappen van de cellen betekent dat het meer lijkt op het weefsel in vivo dan gevestigde cellijnen.
2. Explant weefsels behouden hun eigen cytokines en groeifactoren, wat betekent dat de proliferatie minder stressvol is en biologisch relevanter.
3. Cellen migreren van explant zijn in moleculaire communicatie met de metgezel cellen van de explant, dit biedt cruciale biochemische en biomechanische signalen die essentieel zijn voor weefsel morfogenese, differentiatie en homeostase.

Wanneer kan ik deze methode gebruiken?

Explant cultuur wordt gebruikt in het vaststellen van een verscheidenheid van cellijnen van verschillende bronnen, waaronder zoogdieren, knaagdieren en aviaire. Omdat de culturen meer lijken op de in vivo situatie van cellen is deze techniek nuttig in een breed scala van toepassingen, waaronder het verkrijgen van stamcellen, kankeronderzoek, genetische manipulatie, vaccin productie, geneesmiddelen screening en toxicologie testen.

Hoe voer ik een Explant cultuur uit?

Het verkrijgen van het Explant

Een explant kan chirurgisch worden verkregen met behulp van steriele apparatuur van zoogdieren, knaagdieren of vogels organen of weefsels. Bijvoorbeeld, kan een stuk tandvleesweefsel na tandextractie worden verwijderd als een explant om menselijke gingivale fibroblasten of een stuk vetweefsel kan worden gebruikt om mesenchymale stamcellen vast te stellen.

Snijden en reinigen van de Explant

Als je eenmaal hebt je weefsel is het tijd om te snijden en schoon te maken. U wilt eerst plaats het in een petrischaal met ongeveer 1-2 mL van onvolledig medium (medium zonder serum). Vervolgens kun je het met een scherp chirurgisch mesje in stukken snijden (meestal ongeveer 1×1 mm stukjes). Verzamel de stukjes explant met behulp van een steriele tang en was ze voorzichtig. Wassen kan worden gedaan door de stukjes over te brengen in een centrifugebuisje met ongeveer 0,5 ml onvolledig medium. Meng zachtjes door het medium 4 tot 5 keer te pipetteren, en laat de stukjes bezinken en verwijder het bovenste medium. Dit kan worden herhaald 2 of 3 keer.

Culturing de Explants

Deze verkregen explantaten worden aseptisch geplaatst op een bekleed oppervlak en toegestaan om te hechten aan het oppervlak in de aanwezigheid van een rijke cultuur medium. Dit is gewoonlijk minimaal basaal medium, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) of Minimum Essential Medium Eagle (MEM), aangevuld met 10-15% serum. De explanten worden vervolgens gekweekt in standaard weefselkweekomstandigheden (pH 7,2-7,4, temperatuur 37°C, 5% CO2 en vochtigheid) om celmigratie en -proliferatie mogelijk te maken.

U moet de media om de 3 dagen verversen zonder de explanten te verstoren. Afhankelijk van de gezondheid en de leeftijd van het weefsel, cellen te voorschijn uit de explant binnen 15-30 dagen. Zodra de cellen uit de explant beginnen te groeien, voegt u de volgende dagen 5 ml medium aan de kolf toe.

Subculturing and Establishing Cell Line

Als de explantaten volledig door cellen zijn omgeven, kunt u de cellen trypsiniseren en subculturen. Het is beter een lagere concentratie trypsine te gebruiken (b.v. <0,25% trypsine gedurende 5 min). Kies een geschikte grootte van kolf voor het zaaien, afhankelijk van het totale aantal cellen verkregen.

Challenges in Explant Culture

Hoewel explantaten zijn geweldig om te gebruiken zijn er een paar hindernissen die je moet overwinnen voordat je met hen werkt. De belangrijkste uitdagingen zijn:

• cellen hebben tijd nodig om uit explant te komen, vandaar dat de oprichting van een cellijn ongeveer een maand kan duren
• de mogelijkheid van explant-borne contaminatie
• de generatie van heterogene cellen of een gemengde populatie van cellen.

Maar maak je geen zorgen, hier zijn een paar eenvoudige tips om deze problemen te overwinnen.

Jongere cellen groeien sneller

Als u uw cellen sneller wilt krijgen (binnen 15 dagen), zorg er dan voor dat u de explant verzamelt van een gezonde en jongere donor. Als jongere cellen delen en groeien sneller, ze behouden hun karakteristieke groei in vitro ook, dus de kans op het krijgen van de cellen snel uit de explant zijn zeer hoog.

Vermijd besmetting

De explant-borne besmetting kan worden vermeden door dompelen het weefselstuk in een povidon-jodiumoplossing gedurende 2 tot 3 minuten. Verwijder de resterende povidon-jodium residu door het spoelen van de explant in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,4). U kunt dan de explant in minimaal onvolledig medium en scheiden van harde of dode weefsels als er sprake is.

Het verkrijgen van homogene celpopulatie van een heterogene

Meestal in explant cultuur heterogene cellen worden waargenomen in vroege passages. Om dit probleem op te lossen, moet u uw kennis van de morfologie en het groeipatroon van de cellen waarin u geïnteresseerd bent, toepassen. In het geval van explantatiecultuur van gingivaal weefsel, komen spindelvormige gingivale fibroblastcellen het eerst uit explant, vóór het verschijnen van gingivale keratinocyten cellen.

Gingivale keratinocyten hebben een ovale tot keivormige morfologie en verschijnen een week na het verschijnen van de fibroblastcellen uit de explant en groeien boven de fibroblastcelmonolayer (Figuur 1).

Figuur 1. Propagating Human gingival fibroblast cells with keratinocytes just emerging from gingival explant tissue

Als het doel is om een gingivale fibroblast cellijn vast te stellen uit gingivaal weefsel, laat de kolf confluent worden met fibroblast cellen en vervolgens onmiddellijk subcultuur het. Omdat de keratinocyte cellen minder talrijk zijn, verdwijnen ze in de volgende 3 tot 4 passages (Figuur 2).

Figuur 2. Een monolaag van menselijke gingivale fibroblastcellen

Als het doel is om keratinocyte cellen van gingivale explant vast te stellen, schraap dan de fibroblastcellen uit en voeg keratinocyt-specifiek medium toe aan de kolf, zodat alleen de groei van keratinocyten wordt ondersteund.

Explant methode is een eenvoudige en kosteneffectieve techniek die wordt gebruikt om cellijnen vast te stellen die. histolytische, biochemische en biomechanische eigenschappen hebben die vergelijkbaar zijn met die in vivo. Daarom wordt deze methode aanvaard en op grote schaal gebruikt in de cellulaire en moleculaire biologie. Gebruikt u explantatiecultuur in uw lab? Zou u het overwegen? Laat hieronder een reactie achter.