Mi, miért és hogyan az explántkultúra

Mi az explántkultúra és miért érdemes használni?

Az explántkultúra az állati szövetből vagy szervből sebészi úton eltávolított kis szövetdarabok tenyésztése. Több okból is hasznos módszer.

1. A sejtek szövettani felépítésének és biokémiai tulajdonságainak megőrzése azt jelenti, hogy jobban hasonlít az in vivo szövethez, mint a létrehozott sejtvonalak.
2. Az explant szövetek megtartják saját citokinjeiket és növekedési faktorukat, ami azt jelenti, hogy a proliferáció kevésbé stresszes és biológiailag relevánsabb.
3. Az explantátumból vándorló sejtek molekuláris kommunikációban állnak az explantátum kísérő sejtjeivel, ami létfontosságú biokémiai és biomechanikai jeleket biztosít, amelyek elengedhetetlenek a szövetek morfogeneziséhez, differenciálódásához és homeosztázisához.

Mikor használhatom ezt a módszert?

Az explantátumtenyésztést számos különböző forrásból származó sejtvonal létrehozására használják, beleértve emlősöket, rágcsálókat és madarakat. Mivel a tenyészetek jobban hasonlítanak a sejtek in vivo helyzetéhez, ez a technika számos alkalmazásban hasznos, beleértve az őssejtek kinyerését, a rákkutatást, a géntechnológiát, a vakcinagyártást, a gyógyszerszűrést és a toxikológiai vizsgálatokat.

Hogyan kell elvégezni az explantátumtenyésztést?

Elválasztás

Az explantátumot sebészi úton, steril eszközökkel lehet kinyerni emlősök, rágcsálók vagy madarak szerveiből vagy szöveteiből. Például egy foghúzást követő ínyszövetdarab eltávolítható explantátumként emberi ínyfibroblasztok létrehozásához, vagy egy zsírszövetdarab használható mesenchymális őssejtek létrehozásához.

Az explantátum vágása és tisztítása

Ha már megvan a szövet, itt az ideje a vágásnak és a tisztításnak. Először egy Petri-csészébe szeretné helyezni, amely körülbelül 1-2 ml nem teljes táptalajt (szérum nélküli táptalaj) tartalmaz. Ezután egy éles sebészpenge segítségével vágd fel (általában kb. 1×1 mm-es darabokat). Steril csipesszel gyűjtse össze az explantátum darabjait, és óvatosan mossa meg. A mosás úgy is elvégezhető, hogy a darabokat egy kb. 0,5 ml nem teljes tápfolyadékot tartalmazó centrifugacsőbe helyezzük át. Óvatosan keverje össze a közeget 4-5 alkalommal történő pipettázással, majd hagyja, hogy a darabok leülepedjenek, és távolítsa el a felső közeget. Ezt 2-3 alkalommal meg lehet ismételni.

Az explantátumok tenyésztése

A kapott explantátumokat aszeptikusan egy bevont felületre helyezzük, és hagyjuk, hogy gazdag táptalaj jelenlétében a felülethez tapadjanak. Ez általában bazális minimál médium, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) vagy Minimum Essential Medium Eagle (MEM) 10-15% szérummal kiegészítve. Az explantátumokat ezután standard szövettenyésztési körülmények között (pH 7,2-7,4, hőmérséklet 37°C, 5% CO2 és páratartalom) tenyésztik, hogy lehetővé tegyék a sejtek vándorlását és szaporodását.

A táptalajt 3 naponta kell cserélni az explantátumok megzavarása nélkül. A szövet egészségi állapotától és korától függően a sejtek 15-30 napon belül kikerülnek az explantátumból. Amint a sejtek kinövése megkezdődik az explantátumból, a következő napokban adjon 5 ml tápfolyadékot a lombikba.

Subkultiválás és sejtvonal létrehozása

Azt követően, hogy az explantátumokat teljesen körülvették a sejtek, elvégezheti a sejtek tripszinizálását és a szubkultúrát. Jobb, ha alacsonyabb tripszin-koncentrációt használ (pl. <0,25% tripszin 5 percig). Válasszon megfelelő méretű lombikot a beültetéshez, a kapott sejtek teljes számától függően.

Kihívások az explántkultúrában

Míg az explántokat nagyszerűen lehet használni, van néhány akadály, amelyet le kell küzdenie, mielőtt velük dolgozna. A fő kihívások a következők:

• a sejteknek időbe telik, mire kibújnak az explantátumból, ezért egy sejtvonal létrehozása körülbelül egy hónapig is eltarthat
• az explantátumból származó szennyeződés lehetősége
• a heterogén sejtek vagy vegyes sejtpopuláció létrehozása.

De ne aggódjon, íme néhány egyszerű tipp, amellyel leküzdheti ezeket a problémákat.

A fiatalabb sejtek gyorsabban nőnek

Ha gyorsabban (15 napon belül) szeretné megkapni a sejtjeit, győződjön meg róla, hogy az explantátumot egészséges és fiatal donortól veszi. Mivel a fiatalabb sejtek gyorsabban osztódnak és növekednek, in vitro is megőrzik jellegzetes növekedésüket, így nagyon nagy az esélye annak, hogy az explantátumból gyorsan megkapja a sejteket.

Kerülje el a szennyeződést

A szövetdarab 2-3 perces povidon-jódos oldatba mártásával elkerülhető az explantátumból származó szennyeződés. A maradék povidon-jód-maradékot az explantátum foszfáttal pufferelt sóoldatban (pH 7,4) történő öblítésével távolítsa el. Ezután az explantátumot minimálisan hiányos táptalajba helyezheti, és leválaszthatja a kemény vagy elhalt szöveteket, ha vannak ilyenek.

Heterogén sejtpopulációból homogén sejtpopuláció elérése

Az explantátumkultúrában általában heterogén sejtek figyelhetők meg a korai passzázsokban. E probléma leküzdéséhez alkalmazza az Önt érdeklő sejtek morfológiájára és növekedési mintázatára vonatkozó ismereteit. Az ínyszövet explantátumkultúra esetében az explantátumból először az orsó alakú ínyfibroblaszt sejtek jelennek meg, mielőtt az ínykeratinociták sejtjei megjelennének.

Az ínykeratinociták morfológiájukban oválisnak vagy macskakövesnek tűnnek, egy héttel az explantátumból kikerült fibroblaszt sejtek után kezdenek megjelenni. és a fibroblaszt sejtmonoréteg fölé nőnek (1. ábra).

1. ábra. Humán gingivális fibroblaszt sejtek szaporítása a gingivális explantátumszövetből éppen kikerülő keratinocitákkal

Ha a cél egy gingivális fibroblaszt sejtvonal létrehozása gingivális szövetből, hagyjuk, hogy a lombik konfluens legyen fibroblaszt sejtekkel, majd azonnal szubkultúrázzuk. Mivel a keratinocita sejtek száma kevesebb, a következő 3-4 passzázs során eltűnnek (2. ábra).

2. ábra. Humán gingivális fibroblaszt sejtek monorétege

Ha a cél keratinocita sejtek létrehozása gingivális explantátumból, kaparjuk ki a fibroblaszt sejteket és adjunk keratinocita specifikus médiumot a lombikba, hogy csak a keratinociták növekedését támogassuk.

Az explantátum módszer egy egyszerű és költséghatékony technika, amelyet olyan sejtvonalak létrehozására használnak, amelyek. hisztolitikus, biokémiai és biomechanikai tulajdonságai hasonlóak az in vivo tulajdonságokhoz. Ezért ez a módszer elfogadott és széles körben használt a sejt- és molekuláris biológiában. Ön használ explantátumkultúrát a laboratóriumában? Fontolóra venné? Hagyjon egy megjegyzést alább.