A forradalmi krio-EM meghódítja a strukturális biológiát

A fehérjék 3D alakjának meghatározására szolgáló forradalmi technika virágzik. A múlt héten a krio-elektronmikroszkópiával (cryo-EM) meghatározott fehérje- és egyéb molekulaszerkezeteket összegyűjtő adatbázis megkapta a 10 000. bejegyzést.

Az Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – az elektronmikroszkópiával megoldott szerkezetek népszerű adattára – az elmúlt években exponenciálisan nőtt, főként a krio-elektronmikroszkópok számának robbanásszerű növekedése miatt a laboratóriumokban világszerte (lásd “Szerkezetkeresők”). Az EMDB más mikroszkópiai módszerekkel megoldott struktúrákat is kurátorként kezel, de a túlnyomó többség krio-EM-et használ.

A technika során fehérjék vagy más biomolekulák oldatait gyorsfagyasztják, majd elektronokkal bombázzák őket, hogy mikroszkópos képeket készítsenek az egyes molekulákról. Ezek alapján rekonstruálható a molekula 3D-s alakja vagy szerkezete. Az ilyen szerkezetek hasznosak a fehérjék működésének feltárásában, a betegségekben fellépő működési zavarok feltárásában és a gyógyszeres célzott kezelésükben.

A strukturális biológusok évtizedekig inkább a röntgenkrisztallográfiát használták, amely a fehérjék kristályosítását, röntgensugarakkal való bombázását és alakjuk rekonstruálását jelenti a diffraktált fény árulkodó mintázataiból. A röntgenkrisztallográfia kiváló minőségű struktúrákat hoz létre, de nem minden fehérje esetében alkalmazható könnyen – egyes fehérjék kristályosítása hónapokig vagy évekig is eltarthat, mások pedig egyáltalán nem kristályosodnak ki. A krio-EM nem igényel fehérjekristályokat, de a technika elsorvadt, mert hajlamos volt alacsony felbontású struktúrákat létrehozni – egyes tudósok blobológiának nevezték.

Tökéletes kép

A hardver és szoftver terén 2012-13-ban áttörést értek el, és érzékenyebb elektronmikroszkópokat, valamint kifinomult szoftvereket hoztak létre az általuk rögzített képek élesebb molekulaszerkezetekké alakítására (lásd “Finom részletek”). Ez megnyitotta az utat a krio-EM jelenlegi növekedése előtt, mondja Sjors Scheres, a cambridge-i MRC Laboratory of Molecular Biology (LMB) szerkezeti biológusa és a technika szakértője.

Richard Henderson, az LMB szerkezeti biológusa, aki a technika kifejlesztéséért megosztva kapta a 2017-es kémiai Nobel-díjat, azt mondja, hogy még ezen előrelépések után is kezdetben lassú volt a növekedés, mivel csak kevés laboratóriumnak volt hozzáférése a berendezéshez. Amikor azonban elkezdték használni a krio-EM-et olyan molekulák részletes térképének elkészítésére, mint például a riboszóma – a sejtek fehérjekészítő gépei -, más tudósok, valamint intézményeik és finanszírozóik is gyorsan felfigyeltek rájuk. “Mindazoknak, akik más dolgokba fektettek be, és rossz döntéseket hoztak, egy évbe telt, mire felzárkóztak” – mondja Henderson.

Becslése szerint 2024-re több fehérjeszerkezetet határoznak meg krio-EM segítségével, mint röntgenkrisztallográfiával. A krio-EM már most kiszorította a röntgenkrisztallográfiát a tudósokat különösen érdeklő fehérjék egy kategóriája, a sejtmembránokba ágyazott fehérjék esetében. Számos ilyen membránhoz kötött fehérje szerepet játszik a betegségek kialakulásában, és gyógyszerek célpontjaként szolgál.

A fejlett képalkotás

A krio-EM-mel meghatározott molekulák szerkezete is egyre részletesebbé válik, köszönhetően a hardver és a szoftver folyamatos fejlesztésének, mondja Scheres.

A kezdetben a legélesebb krio-EM szerkezeteket a nagyon stabil fehérjék alkották, amelyeket a technológia határainak tesztelésére használtak. Scheres azonban észrevette, hogy a kutatók egyre inkább nagyon nagy felbontású struktúrákat kapnak orvosilag fontos molekulákról, például sejtmembránfehérjékről, még akkor is, ha ezek hajlamosak floppolni.

“Most jutottunk el arra a pontra, amikor a könnyű mintákkal már végeztünk, és az emberek összetettebb problémákkal foglalkoznak” – mondja Ardan Patwardhan, a brit Hinxtonban működő Európai Molekuláris Biológiai Laboratórium-Európai Bioinformatikai Intézet szerkezeti biológusa, aki az EMDB-t működtető csoportot vezeti.

Henderson arra számít, hogy a krio-EM szerkezetek boomja egy idő után lelassul. Szerinte az egyik tényező, amely visszafoghatja a növekedést, a legnagyobb teljesítményű mikroszkópok magas ára, amely meghaladhatja az 5 millió fontot (7 millió USD). Emellett napi több ezer fontba kerül a működtetésük, és olyan speciális laboratóriumokat igényelnek, amelyek minimalizálják a rezgéseket. Henderson azért kampányol, hogy meggyőzze a cégeket olcsóbb, de még mindig hasznos mikroszkópok kifejlesztéséről, amelyek még jobban elterjeszthetnék a technikát. “Jelenleg nem lehet rosszul járni, ha több befektetést fektetünk a krio-EM-be” – mondja.