Le quoi, le pourquoi et le comment de la culture d’explants

Qu’est-ce que la culture d’explants et pourquoi devrais-je l’utiliser?

La culture d’explants est la culture de petits morceaux de tissus prélevés chirurgicalement sur un tissu ou un organe animal. C’est une méthode utile pour plusieurs raisons.

1. Le maintien de l’architecture histotypique et des propriétés biochimiques des cellules signifie qu’elle ressemble plus étroitement au tissu in vivo que les lignées cellulaires établies.
2. Les tissus d’explant conservent leurs propres cytokines et facteurs de croissance, ce qui signifie que la prolifération est moins stressante et plus pertinente sur le plan biologique.
3. Les cellules qui migrent de l’explant sont en communication moléculaire avec les cellules compagnes de l’explant, cela fournit des signaux biochimiques et biomécaniques cruciaux qui sont essentiels pour la morphogenèse, la différenciation et l’homéostasie des tissus.

Quand puis-je utiliser cette méthode ?

La culture d’explants est utilisée pour établir une variété de lignées cellulaires provenant de différentes sources, y compris les mammifères, les rongeurs et les aviaires. Parce que les cultures ressemblent plus étroitement à la situation in vivo des cellules, cette technique est utile dans une grande variété d’applications, y compris l’obtention de cellules souches, la recherche sur le cancer, le génie génétique, la production de vaccins, le dépistage de médicaments et les tests toxicologiques.

Comment réaliser une culture d’explant ?

Obtention de l’explant

Un explant peut être obtenu chirurgicalement en utilisant un équipement stérile à partir d’organes ou de tissus de mammifères, de rongeurs ou d’oiseaux. Par exemple, un morceau de tissu gingival après une extraction dentaire peut être prélevé comme explant pour établir des fibroblastes gingivaux humains ou un morceau de tissu adipeux peut être utilisé pour établir des cellules souches mésenchymateuses.

Couper et nettoyer l’explant

Une fois que vous avez votre tissu, il est temps de le couper et de le nettoyer. Vous voulez d’abord le placer dans une boîte de Pétri contenant environ 1 à 2 ml de milieu incomplet (milieu sans sérum). Ensuite, à l’aide d’une lame chirurgicale aiguisée, vous pouvez le couper (généralement des morceaux d’environ 1×1 mm). Récupérez les morceaux d’explant à l’aide d’une pince stérile et lavez-les délicatement. Le lavage peut être effectué en transférant les morceaux dans un tube à centrifuger contenant environ 0,5 ml de milieu incomplet. Mélangez doucement en pipettant le milieu 4 à 5 fois, puis laissez les morceaux se déposer et retirez le milieu supérieur. Cette opération peut être répétée 2 ou 3 fois.

Culture des explants

Ces explants obtenus sont placés de façon aseptique sur une surface revêtue et on les laisse se fixer à la surface en présence d’un milieu de culture riche. Il s’agit généralement d’un milieu minimal basal, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) ou le milieu essentiel minimal Eagle (MEM) complété par 10-15% de sérum. Les explants sont ensuite cultivés dans des conditions standard de culture de tissus (pH 7,2-7,4, température 37°C, 5% de CO2 et humidité) pour permettre la migration et la prolifération des cellules.

Vous devez changer le milieu tous les 3 jours sans perturber les explants. Selon la santé et l’âge du tissu, les cellules émergent de l’explant en 15 à 30 jours. Une fois que l’excroissance des cellules commence à partir de l’explant, ajoutez 5 ml de milieu dans le flacon les jours suivants.

Sous-culture et établissement de la lignée cellulaire

Après que les explants soient complètement entourés par les cellules, vous pouvez trypsiner les cellules et les sous-cultiver. Il est préférable d’utiliser une concentration plus faible de trypsine (par exemple <0,25% de trypsine pendant 5 min). Choisissez une taille appropriée de flacon pour l’ensemencement, en fonction du nombre total de cellules obtenues.

Défis de la culture d’explants

Bien que les explants soient formidables à utiliser, il existe quelques obstacles que vous devez surmonter avant de travailler avec eux. Les principaux défis sont :

• les cellules prennent du temps pour émerger de l’explant, donc l’établissement d’une lignée cellulaire pourrait prendre environ un mois
• la possibilité de contamination par l’explant
• la génération de cellules hétérogènes ou d’une population mixte de cellules.

Mais ne vous inquiétez pas, voici quelques conseils simples pour surmonter ces problèmes.

Les cellules plus jeunes se développent plus vite

Si vous voulez obtenir vos cellules plus rapidement (dans les 15 jours), assurez-vous de prélever l’explant sur un donneur sain et plus jeune. Comme les cellules plus jeunes se divisent et se développent plus rapidement, elles conservent leur croissance caractéristique in vitro également, les chances d’obtenir les cellules rapidement à partir de l’explant sont donc très élevées.

Éviter la contamination

La contamination portée par l’explant peut être évitée en trempant le morceau de tissu dans une solution de povidone-iode pendant 2 à 3 min. Eliminez le résidu de povidone-iode restant en rinçant l’explant dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4). Vous pouvez ensuite placer l’explant dans un milieu incomplet minimal et séparer les tissus durs ou morts s’il y en a.

Obtenir une population cellulaire homogène à partir d’une population hétérogène

En général, dans la culture d’explants, on observe des cellules hétérogènes dans les premiers passages. Pour surmonter ce problème, appliquez vos connaissances sur la morphologie et le mode de croissance des cellules qui vous intéressent. Dans le cas de la culture d’explant de tissu gingival, les cellules fibroblastes gingivales fusiformes émergent en premier de l’explant, avant l’apparition des cellules kératinocytes gingivales.

Les kératinocytes gingivaux ont une morphologie ovale à pavé, commencent à apparaître une semaine après l’émergence des cellules fibroblastiques de l’explant. et se développent au-dessus de la monocouche de cellules fibroblastiques (Figure 1).

Figure 1. Propagation de cellules de fibroblastes gingivaux humains avec des kératinocytes qui viennent d’émerger du tissu d’explant gingival

Si l’objectif est d’établir une lignée de cellules de fibroblastes gingivaux à partir de tissu gingival, laissez le flacon devenir confluent avec les cellules de fibroblastes, puis mettez-le immédiatement en sous-culture. Comme les cellules kératinocytaires sont moins nombreuses, elles disparaissent au cours des 3 à 4 passages suivants (figure 2).

Figure 2. Une monocouche de cellules de fibroblastes gingivaux humains

Si l’objectif est d’établir des cellules de kératinocytes à partir d’un explant gingival, grattez les cellules de fibroblastes et ajoutez un milieu spécifique aux kératinocytes dans le flacon afin que seule la croissance des kératinocytes soit soutenue.

La méthode d’explant est une technique simple et rentable utilisée pour établir des lignées cellulaires qui ont. des propriétés histolytiques, biochimiques et biomécaniques similaires à celles in vivo. Par conséquent, cette méthode est acceptée et largement utilisée en biologie cellulaire et moléculaire. Utilisez-vous la culture d’explants dans votre laboratoire ? L’envisageriez-vous ? Laissez un commentaire ci-dessous.

.