Vallankumouksellinen kryo-EM valloittaa rakennebiologian

Vallankumouksellinen tekniikka proteiinien kolmiulotteisen muodon määrittämiseksi kukoistaa. Viime viikolla tietokantaan, johon kerätään kryoelektronimikroskopialla eli kryo-EM:llä määritettyjä proteiini- ja muita molekyylirakenteita, tuli 10 000. merkintä.

Elektronimikroskopian tietopankkiin (Electron Microscopy Data Bank, EMDB) – elektronimikroskopialla ratkaistujen rakenteiden suosittuun tietopankkiin – tehdyt merkinnät ovat lisääntyneet räjähdysmäisen nopeasti viime vuosina, mikä johtuu suurelta osin siitä, että kryoelektronimikroskooppien määrä on kasvanut räjähdysmäisesti eri puolilla maailmaa sijaitsevien laboratorioiden keskuudessa. EMDB:ssä kuratoidaan muillakin mikroskopointimenetelmillä ratkaistuja rakenteita, mutta valtaosa käyttää kryo-EM:ää.

Tekniikkaan kuuluu proteiinien tai muiden biomolekyylien liuosten pikapakastaminen, minkä jälkeen niitä pommitetaan elektroneilla, jolloin saadaan mikroskooppikuvia yksittäisistä molekyyleistä. Näiden avulla voidaan rekonstruoida molekyylin 3D-muoto eli rakenne. Tällaiset rakenteet ovat hyödyllisiä, kun selvitetään, miten proteiinit toimivat, miten ne eivät toimi sairauksissa ja miten niihin voidaan kohdistaa lääkkeitä.

Kymmeniä vuosia rakennebiologit käyttivät mieluummin röntgenkristallografiaa, eli tekniikkaa, jossa proteiineja kiteytetään, niitä pommitetaan röntgensäteillä ja niiden muoto rekonstruoidaan saatujen diffraktiokuvioiden perusteella. Röntgenkristallografia tuottaa korkealaatuisia rakenteita, mutta sitä ei ole helppo käyttää kaikkiin proteiineihin – joidenkin proteiinien kiteytyminen voi kestää kuukausia tai vuosia, ja toiset eivät kiteydy lainkaan. Kryo-EM ei vaadi proteiinikiteitä, mutta tekniikka kuihtui, koska se tuotti yleensä matalaresoluutioisia rakenteita – jotkut tutkijat kutsuivat sitä blobologiaksi.

Kuva on täydellinen

Laitteistojen ja ohjelmistojen läpimurrot vuosina 2012-13 tuottivat herkempiä elektronimikroskooppeja ja kehittyneitä ohjelmistoja, joiden avulla ne voivat muuntaa kuvattuja kuvia terävämmiksi molekyylirakenteiksi (ks. kohta ”Hienoja yksityiskohtia”). Tämä tasoitti tietä kryo-EM:n nykyiselle kasvulle, sanoo Sjors Scheres, rakennebiologi ja tekniikan asiantuntija MRC:n molekyylibiologian laboratoriossa (Laboratory of Molecular Biology, LMB) Cambridgessa, Isossa-Britanniassa.

Richard Henderson, LMB:n rakennebiologi, joka jakoi vuoden 2017 kemian Nobel-palkinnon työstään tekniikan kehittämisessä, sanoo, että näiden edistysaskeleiden jälkeenkin kasvu oli aluksi hidasta, koska laitteisto oli vain pienellä joukolla laboratorioita käytettävissä. Mutta kun he alkoivat käyttää kryo-EM:ää yksityiskohtaisten karttojen tuottamiseen molekyyleistä, kuten ribosomista – solujen proteiineja valmistavista koneista – muut tutkijat sekä heidän laitoksensa ja rahoittajansa kiinnittivät nopeasti huomiota. ”Kaikilta ihmisiltä, jotka olivat panostaneet muihin asioihin ja tehneet vääriä päätöksiä, kesti vuosi saada heidät kiinni”, Henderson sanoo.

Hän arvioi, että vuoteen 2024 mennessä kryo-EM:llä määritetään enemmän proteiinien rakenteita kuin röntgenkristallografialla. Kryo-EM on jo syrjäyttänyt röntgenkristallografian eräässä proteiiniryhmässä, josta tutkijat ovat erityisen kiinnostuneita – solukalvoihin sulautuneissa proteiineissa. Monet tällaiset kalvoihin sidotut proteiinit ovat osallisina sairauksissa ja toimivat lääkkeiden kohteina.

Kehittynyt kuvantaminen

Kryo-EM:llä määritettyjen molekyylien rakenteet ovat myös muuttumassa yhä yksityiskohtaisemmiksi laitteistojen ja ohjelmistojen jatkuvan parantumisen ansiosta, Scheres sanoo.

Aluksi terävimmät kryo-EM-rakenteet olivat erittäin stabiileja proteiineja, joita käytettiin testaamaan tekniikan rajoja. Scheres on kuitenkin huomannut, että tutkijat saavat yhä useammin hyvin korkearesoluutioisia rakenteita lääketieteellisesti tärkeistä molekyyleistä, kuten solukalvoproteiineista, vaikka niillä on taipumus heilua.

”Olemme nyt tulossa siihen pisteeseen, että helpot näytteet on tehty ja ihmiset tarkastelevat monimutkaisempia ongelmia”, sanoo Ardan Patwardhan, rakennebiologi Euroopan molekyylibiologian laboratoriossa (European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute) Hinxtonissa, Isossa-Britanniassa, joka johtaa EMDB:tä ylläpitävää ryhmää.

Henderson odottaa kryo-EM-rakenteiden boomin hidastuvan jossain vaiheessa. Yksi kasvua vaimentava tekijä on hänen mukaansa tehokkaimpien mikroskooppien korkea hinta, joka voi ylittää 5 miljoonaa puntaa (7 miljoonaa dollaria). Niiden käyttö maksaa myös tuhansia puntia päivässä, ja ne vaativat erikoislaboratorioita, joissa tärinät minimoidaan. Henderson kampanjoi saadakseen yritykset kehittämään halvempia mutta silti käyttökelpoisia mikroskooppeja, jotka voisivat levittää tekniikkaa entisestään. ”Tällä hetkellä ei voi mennä pieleen investoimalla enemmän kryo-EM:ään”, hän sanoo.