Mitä, miksi ja miten eksplantin viljely

Mitä on eksplantin viljely ja miksi sitä pitäisi käyttää?

Eksplantin viljely on pienten kudospalojen viljelyä, jotka on poistettu kirurgisesti eläimen kudoksesta tai elimestä. Se on hyödyllinen menetelmä useista syistä.

1. Solujen histotyyppisen arkkitehtuurin ja biokemiallisten ominaisuuksien säilyttäminen tarkoittaa, että se muistuttaa enemmän kudosta in vivo kuin vakiintuneet solulinjat.
2. Explanttikudokset säilyttävät omat sytokiininsä ja kasvutekijänsä, mikä tarkoittaa, että proliferaatio on vähemmän stressaavaa ja biologisesti merkityksellisempää.
3. Solut, jotka vaeltavat eksplantaatista, ovat molekyylikommunikaatiossa eksplantaatin kumppanuussolujen kanssa, mikä antaa ratkaisevia biokemiallisia ja biomekaanisia signaaleja, jotka ovat välttämättömiä kudoksen morfogeneesille, erilaistumiselle ja homeostaasille.

Kuinka tätä menetelmää voi käyttää?

Eksplanttiviljelyä käytetään useiden solulinjojen perustamiseen eri lähteistä, mukaan lukien nisäkkäistä, jyrsijöistä ja linnuista. Koska viljelmät muistuttavat enemmän solujen in vivo -tilannetta, tämä tekniikka on käyttökelpoinen monenlaisissa sovelluksissa, kuten kantasolujen saamisessa, syöpätutkimuksessa, geenitekniikassa, rokotteiden tuotannossa, lääkeaineiden seulonnassa ja toksikologisessa testauksessa.

Miten suoritan eksplanttiviljelyn?

Eksplanttiviljelmän saaminen

Eksplanttiviljelmä voidaan hankkia kirurgisesti steriilillä välineistöllä nisäkkäiden, jyrsijöiden tai lintujen elimistä tai kudoksista. Eksplanttina voidaan käyttää esimerkiksi hampaan poiston jälkeistä ientaskukudoksen palaa ihmisen ientaskukudoksen fibroblastien muodostamiseksi tai rasvakudoksen palaa voidaan käyttää mesenkymaalisten kantasolujen muodostamiseksi.

Explantin leikkaaminen ja puhdistaminen

Kun kudos on saatu, on aika leikata ja puhdistaa se. Haluat ensin asettaa sen petrimaljaan, jossa on noin 1-2 ml epätäydellistä mediumia (medium ilman seerumia). Sitten voit leikata sen terävällä kirurgisella terällä (yleensä noin 1×1 mm:n paloja). Kerää eksplanttikappaleet steriileillä pihdeillä ja pese varovasti. Pesu voidaan tehdä siirtämällä palat sentrifugiputkeen, joka sisältää noin 0,5 ml epätäydellistä elatusainetta. Sekoitetaan varovasti pipetoimalla väliaine 4-5 kertaa, annetaan palojen laskeutua ja poistetaan ylempi väliaine. Tämä voidaan toistaa 2 tai 3 kertaa.

Esplantaattien viljely

Tuloksena saadut eksplantaatit asetetaan aseptisesti päällystetylle pinnalle ja niiden annetaan kiinnittyä pinnalle runsaassa kasvatusalustassa. Tämä on yleensä minimaalinen perusmedia, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) tai Minimum Essential Medium Eagle (MEM), jota on täydennetty 10-15 %:lla seerumia. Tämän jälkeen eksplantaatteja viljellään tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa (pH 7,2-7,4, lämpötila 37 °C, 5 % CO2 ja ilmankosteus), jotta solujen migraatio ja proliferaatio mahdollistuvat.

Väliaine on vaihdettava 3 päivän välein ilman, että eksplantaatteja häiritään. Kudoksen terveydestä ja iästä riippuen solut irtoavat eksplantaatista 15-30 päivän kuluessa. Kun solujen kasvaminen eksplantaatista alkaa, lisää pulloihin 5 ml elatusainetta seuraavina päivinä.

Subkultivointi ja solulinjan perustaminen

Kun eksplantaatit ovat täysin solujen ympäröimiä, voit trypsiiniä solut ja subkultivoida ne. On parempi käyttää pienempää trypsiinipitoisuutta (esim. <0,25 % trypsiiniä 5 minuutin ajan). Valitse sopivan kokoinen pullo kylvöä varten riippuen saatujen solujen kokonaismäärästä.

Explanttien viljelyyn liittyvät haasteet

Kaikkakin eksplantteja on hieno käyttää, on olemassa muutamia esteitä, jotka on voitettava, ennen kuin voit työskennellä niiden kanssa. Tärkeimmät haasteet ovat:

• solujen syntyminen eksplantaatista vie aikaa, joten solulinjan perustaminen saattaa kestää noin kuukauden
• eksplantaatista peräisin olevan kontaminaation mahdollisuus
• heterogeenisten solujen tai sekoittuneen solupopulaation syntyminen.

Mutta ei hätää, tässä on muutama yksinkertainen vinkki näiden ongelmien voittamiseksi.

Nuoremmat solut kasvavat nopeammin

Jos haluat saada solusi nopeammin (15 päivän kuluessa), varmista, että otat eksplanttisi terveeltä ja nuorelta luovuttajalta. Koska nuoremmat solut jakautuvat ja kasvavat nopeammin, ne säilyttävät niille ominaisen kasvunsa myös in vitro, joten mahdollisuudet saada soluja nopeasti eksplantaatista ovat hyvin suuret.

Välttää kontaminaatiota

Eksplantaatista peräisin oleva kontaminaatio voidaan välttää kastamalla kudospala povidonijodiliuokseen 2-3 minuutiksi. Jäljellä oleva povidonijodijodijäämä poistetaan huuhtelemalla eksplanttia fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,4). Tämän jälkeen voit asettaa eksplanttia minimaaliseen epätäydelliseen väliaineeseen ja erottaa kovat tai kuolleet kudokset, jos niitä on.

Homogeenisen solupopulaation saaminen heterogeenisesta

Yleensä eksplanttiviljelyssä havaitaan heterogeenisia soluja varhaisissa passageissa. Voit ratkaista tämän ongelman soveltamalla tietämystäsi haluamiesi solujen morfologiasta ja kasvumallista. Kun kyseessä on ientaskukudoksen eksplanttiviljely, spindelinmuotoiset ientaskun fibroblastisolut syntyvät eksplantaatista ensin ennen ientaskun keratinosyyttisolujen ilmaantumista.

Gingivaaliset keratinosyytit näyttävät morfologialtaan soikeilta tai mukulakivimaisilta, alkavat ilmestyä viikko sen jälkeen, kun fibroblastisolut ovat ilmaantuneet eksplantaatista. ja kasvavat fibroblastisolujen monokerroksen yläpuolella (kuva 1).

Kuva 1. Explanttiviljelyssä käytettävät solut. Ihmisen gingivaalisten fibroblastisolujen kasvattaminen keratinosyyttien kanssa, jotka ovat juuri syntymässä gingivaalisesta eksplanttikudoksesta

Jos tavoitteena on luoda gingivaalinen fibroblastisolulinja gingivaalisesta kudoksesta, anna pullon konfluentoitua fibroblastisoluilla ja viljele se välittömästi subkultuuriin. Koska keratinosyyttisoluja on vähemmän, ne häviävät seuraavissa 3-4 passageissa (kuva 2).

Kuva 2. Ihmisen ientaskun fibroblastisolujen monokerros

Jos tavoitteena on keratinosyyttisolujen muodostaminen ientaskun eksplantaatista, fibroblastisolut kaapitaan pois ja kolviin lisätään keratinosyyttispesifistä elatusainetta niin, että vain keratinosyyttien kasvua tuetaan.

Eksplantaatiomenetelmä on yksinkertainen ja kustannustehokas tekniikka, jota käytetään perustamaan solulinjoja, joilla on. histolyysi-ominaisuuksiltaan, biologisilta ominaisuuksiltaan, bio- ja biomekaanisilta ominaisuuksiltaan samanlaiset ominaisuudet kuin ne, jotka ovat samanlaisia kuin in vivo. Siksi tämä menetelmä on hyväksytty ja sitä käytetään laajalti solu- ja molekyylibiologiassa. Käytätkö eksplanttiviljelyä laboratoriossasi? Harkitsisitko sitä? Jätä kommentti alle.