El qué, el porqué y el cómo del cultivo de explantes

¿Qué es el cultivo de explantes y por qué debería utilizarlo?

El cultivo de explantes es el cultivo de pequeños trozos de tejido extraídos quirúrgicamente de un tejido u órgano animal. Es un método útil por varias razones.

1. El mantenimiento de la arquitectura histotípica y las propiedades bioquímicas de las células significa que se asemeja más al tejido in vivo que las líneas celulares establecidas.
2. Los tejidos de los explantes retienen sus propias citoquinas y factores de crecimiento, lo que significa que la proliferación es menos estresante y más relevante biológicamente.
3. Las células que migran desde el explante están en comunicación molecular con las células compañeras del explante, lo que proporciona señales bioquímicas y biomecánicas cruciales que son esenciales para la morfogénesis, la diferenciación y la homeostasis del tejido.

¿Cuándo puedo utilizar este método?

El cultivo de explantes se utiliza para establecer una variedad de líneas celulares de diferentes fuentes, incluyendo mamíferos, roedores y aves. Debido a que los cultivos se asemejan más a la situación in vivo de las células, esta técnica es útil en una amplia variedad de aplicaciones que incluyen la obtención de células madre, la investigación del cáncer, la ingeniería genética, la producción de vacunas, el cribado de fármacos y las pruebas de toxicología.

¿Cómo se realiza un cultivo de explantes?

Obtención del explante

Un explante puede obtenerse quirúrgicamente utilizando un equipo estéril a partir de órganos o tejidos de mamíferos, roedores o aves. Por ejemplo, un trozo de tejido gingival tras la extracción de un diente puede extraerse como explante para establecer fibroblastos gingivales humanos o un trozo de tejido adiposo puede utilizarse para establecer células madre mesenquimales.

Cortar y limpiar el explante

Una vez que tenga su tejido es el momento de cortarlo y limpiarlo. Primero hay que colocarlo en una placa de Petri que contenga alrededor de 1-2 mL de medio incompleto (medio sin suero). A continuación, con una cuchilla quirúrgica afilada, puedes cortarlo (normalmente en trozos de 1×1 mm). Recoge los trozos de explante con una pinza estéril y lávalos suavemente. El lavado puede realizarse transfiriendo los trozos a un tubo de centrífuga que contenga unos 0,5 mL de medio incompleto. Mezclar suavemente pipeteando el medio 4 o 5 veces, y dejar que las piezas se asienten y eliminar el medio superior. Esto puede repetirse 2 o 3 veces.

Cultivo de los explantes

Los explantes obtenidos se colocan asépticamente en una superficie recubierta y se dejan adherir a la superficie en presencia de un medio de cultivo rico. Suele tratarse de un medio mínimo basal, el Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) o el Medio Esencial Mínimo Eagle (MEM) complementado con un 10-15% de suero. A continuación, los explantes se cultivan en condiciones estándar de cultivo de tejidos (pH 7,2-7,4, temperatura 37°C, 5% de CO2 y humedad) para permitir la migración y proliferación de las células.

Es necesario cambiar el medio cada 3 días sin perturbar los explantes. Dependiendo de la salud y la edad del tejido, las células salen del explante en 15-30 días. Una vez que las células empiecen a salir del explante, añada 5 mL de medio al matraz en los días siguientes.

Subcultivo y establecimiento de la línea celular

Después de que los explantes estén completamente rodeados de células, puede tripsinizar las células y subcultivar. Es mejor utilizar una concentración menor de tripsina (por ejemplo, <0,25% de tripsina durante 5 minutos). Elija un tamaño adecuado de matraz para la siembra, en función del número total de células obtenidas.

Desafíos en el cultivo de explantes

Aunque los explantes son estupendos de utilizar, hay algunos obstáculos que hay que superar antes de trabajar con ellos. Los principales retos son:

• Las células tardan en salir del explante, por lo que el establecimiento de una línea celular puede tardar alrededor de un mes
• La posibilidad de contaminación transmitida por el explante
• La generación de células heterogéneas o una población mixta de células.

Pero no se preocupe, aquí tiene unos sencillos consejos para superar estos problemas.

Las células más jóvenes crecen más rápido

Si quiere obtener sus células más rápido (en un plazo de 15 días), asegúrese de recoger el explante de un donante sano y joven. Como las células más jóvenes se dividen y crecen más rápido, también conservan su crecimiento característico in vitro, por lo que las posibilidades de obtener las células rápidamente del explante son muy altas.

Evite la contaminación

La contaminación transmitida por el explante puede evitarse sumergiendo la pieza de tejido en una solución de povidona yodada durante 2 o 3 minutos. Elimine el residuo de povidona yodada restante enjuagando el explante en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). A continuación, puede colocar el explante en un medio mínimamente incompleto y separar los tejidos duros o muertos si los hay.

Obtención de una población celular homogénea a partir de una heterogénea

Por lo general, en el cultivo de explantes se observan células heterogéneas en los primeros pasajes. Para superar este problema, aplique sus conocimientos sobre la morfología y el patrón de crecimiento de las células que le interesan. En el caso del cultivo de explantes de tejido gingival, las células de fibroblastos gingivales con forma de huso emergen primero del explante, antes de la aparición de las células de queratinocitos gingivales.

Los queratinocitos gingivales tienen una morfología entre ovalada y adoquinada, y empiezan a aparecer una semana después de que las células de fibroblastos hayan emergido del explante y crecen por encima de la monocapa de células de fibroblastos (Figura 1).

Figura 1. Propagación de células de fibroblastos gingivales humanos con queratinocitos que acaban de emerger del tejido del explante gingival

Si el objetivo es establecer una línea celular de fibroblastos gingivales a partir de tejido gingival, deje que el matraz se vuelva confluente con células de fibroblastos y, a continuación, subcúltelo inmediatamente. Como las células de queratinocitos son menos numerosas, desaparecen en los 3 ó 4 pases siguientes (Figura 2).

Figura 2. Una monocapa de células de fibroblastos gingivales humanos

Si el objetivo es establecer células de queratinocitos a partir de un explante gingival, raspe las células de fibroblastos y añada un medio específico para queratinocitos al matraz, de modo que sólo se apoye el crecimiento de los queratinocitos.

El método de explante es una técnica sencilla y rentable que se utiliza para establecer líneas celulares que tienen. propiedades histolíticas, bioquímicas y biomecánicas similares a las in vivo. Por ello, este método es aceptado y ampliamente utilizado en biología celular y molecular. ¿Utiliza el cultivo de explantes en su laboratorio? ¿Lo tendrías en cuenta? Deja un comentario a continuación.