Das Was, Warum und Wie der Explantationskultur

Was ist Explantationskultur und warum sollte ich sie verwenden?

Explantationskultur ist die Kultur kleiner Gewebestücke, die chirurgisch aus tierischem Gewebe oder Organen entnommen wurden. Sie ist aus mehreren Gründen eine nützliche Methode.

1. Die Beibehaltung der histotypischen Architektur und der biochemischen Eigenschaften der Zellen bedeutet, dass sie dem Gewebe in vivo ähnlicher ist als etablierte Zelllinien.
2. Explantatgewebe behält seine eigenen Zytokine und Wachstumsfaktoren, was bedeutet, dass die Proliferation weniger belastend und biologisch relevanter ist.
3. Zellen, die aus dem Explantat wandern, stehen in molekularer Kommunikation mit den Komplementärzellen des Explantats. Dies liefert entscheidende biochemische und biomechanische Signale, die für die Gewebemorphogenese, -differenzierung und -homöostase unerlässlich sind.

Wann kann ich diese Methode verwenden?

Explantatkulturen werden für die Etablierung einer Vielzahl von Zelllinien aus verschiedenen Quellen verwendet, darunter Säugetiere, Nager und Vögel. Da die Kulturen der In-vivo-Situation von Zellen näher kommen, ist diese Technik für eine Vielzahl von Anwendungen nützlich, einschließlich der Gewinnung von Stammzellen, Krebsforschung, Gentechnik, Impfstoffherstellung, Arzneimittelscreening und Toxikologietests.

Wie führe ich eine Explantatkultur durch?

Gewinnung des Explantats

Ein Explantat kann chirurgisch mit steriler Ausrüstung aus Organen oder Geweben von Säugetieren, Nagetieren oder Vögeln gewonnen werden. Zum Beispiel kann ein Stück Zahnfleischgewebe nach einer Zahnextraktion als Explantat entnommen werden, um menschliche Zahnfleischfibroblasten zu etablieren, oder ein Stück Fettgewebe kann verwendet werden, um mesenchymale Stammzellen zu etablieren.

Schnitt und Reinigung des Explantats

Wenn Sie Ihr Gewebe haben, müssen Sie es schneiden und reinigen. Dazu legst du es zunächst in eine Petrischale, die etwa 1-2 ml unvollständiges Medium (Medium ohne Serum) enthält. Dann können Sie es mit einer scharfen chirurgischen Klinge schneiden (normalerweise etwa 1×1 mm große Stücke). Fangen Sie die Explantatstücke mit einer sterilen Pinzette auf und waschen Sie sie vorsichtig. Zum Waschen können Sie die Stücke in ein Zentrifugenröhrchen geben, das etwa 0,5 ml unvollständiges Medium enthält. Das Medium 4 bis 5 Mal mit einer Pipette vorsichtig durchmischen, die Stücke absetzen lassen und das obere Medium entfernen. Dieser Vorgang kann zwei- oder dreimal wiederholt werden.

Kultivierung der Explantate

Die so gewonnenen Explantate werden aseptisch auf eine beschichtete Oberfläche gelegt und in Gegenwart eines reichhaltigen Kulturmediums anhaften gelassen. Dabei handelt es sich in der Regel um basale Minimalmedien, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) oder Minimum Essential Medium Eagle (MEM), ergänzt mit 10-15 % Serum. Die Explantate werden dann unter Standard-Gewebekulturbedingungen (pH 7,2-7,4, Temperatur 37°C, 5% CO2 und Luftfeuchtigkeit) kultiviert, um die Zellmigration und -vermehrung zu ermöglichen.

Die Medien müssen alle drei Tage gewechselt werden, ohne die Explantate zu stören. Je nach Gesundheit und Alter des Gewebes wachsen die Zellen innerhalb von 15-30 Tagen aus dem Explantat heraus. Sobald die Zellen aus dem Explantat herauswachsen, geben Sie in den folgenden Tagen 5 ml Medium in den Kolben.

Subkultivierung und Etablierung der Zelllinie

Nachdem die Explantate vollständig von Zellen umgeben sind, können Sie die Zellen trypsinieren und subkultivieren. Es ist besser, eine niedrigere Trypsinkonzentration zu verwenden (z. B. <0,25% Trypsin für 5 Minuten). Wählen Sie eine geeignete Kolbengröße für die Aussaat, je nach der Gesamtzahl der erhaltenen Zellen.

Herausforderungen bei der Explantatkultur

Während Explantate großartig zu verwenden sind, gibt es ein paar Hürden, die man überwinden muss, bevor man mit ihnen arbeitet. Die wichtigsten Herausforderungen sind:

• Zellen brauchen Zeit, um aus dem Explantat herauszuwachsen, daher kann die Etablierung einer Zelllinie etwa einen Monat dauern
• die Möglichkeit einer Kontamination durch das Explantat
• die Erzeugung heterogener Zellen oder einer gemischten Zellpopulation.

Aber keine Sorge, hier sind ein paar einfache Tipps, um diese Probleme zu überwinden.

Jüngere Zellen wachsen schneller

Wenn Sie Ihre Zellen schneller (innerhalb von 15 Tagen) erhalten wollen, stellen Sie sicher, dass Sie das Explantat von einem gesunden und jüngeren Spender entnehmen. Da sich jüngere Zellen schneller teilen und wachsen, behalten sie auch in vitro ihr charakteristisches Wachstum bei, so dass die Chancen, die Zellen schnell aus dem Explantat zu erhalten, sehr hoch sind.

Vermeiden Sie Kontamination

Die Kontamination des Explantats kann vermieden werden, indem das Gewebestück 2 bis 3 Minuten lang in eine Povidon-Jod-Lösung getaucht wird. Die verbleibenden Povidon-Iod-Reste werden durch Spülen des Explantats in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) entfernt. Anschließend können Sie das Explantat in minimales, unvollständiges Medium legen und hartes oder abgestorbenes Gewebe aussortieren, falls vorhanden.

Homogene Zellpopulationen aus heterogenen gewinnen

In der Regel werden in der Explantatkultur in frühen Passagen heterogene Zellen beobachtet. Um dieses Problem zu lösen, müssen Sie Ihre Kenntnisse über die Morphologie und das Wachstumsmuster der Zellen, die Sie interessieren, anwenden. Im Falle der Explantatkultur von Zahnfleischgewebe entstehen aus dem Explantat zuerst spindelförmige Zahnfleischfibroblasten, bevor die Zahnfleischkeratinozyten erscheinen.

Gingivale Keratinozyten haben eine ovale bis kopfsteinpflasterartige Morphologie und beginnen eine Woche nach dem Auftauchen der Fibroblastenzellen aus dem Explantat zu erscheinen und wachsen über der Fibroblastenzell-Monolage (Abbildung 1).

Abbildung 1. Vermehrung humaner gingivaler Fibroblastenzellen mit Keratinozyten, die gerade aus gingivalem Explantatgewebe entstehen

Wenn das Ziel darin besteht, eine gingivale Fibroblastenzelllinie aus gingivalem Gewebe zu etablieren, sollte man den Kolben mit Fibroblastenzellen konfluieren lassen und ihn dann sofort subkultivieren. Da die Keratinozytenzellen zahlenmäßig geringer sind, verschwinden sie in den folgenden 3 bis 4 Passagen (Abbildung 2).

Abbildung 2. Ein Monolayer menschlicher Gingivalfibroblasten

Wenn das Ziel darin besteht, Keratinozytenzellen aus einem Gingivalexplantat zu etablieren, schaben Sie die Fibroblastenzellen heraus und fügen dem Kolben ein keratinozytenspezifisches Medium hinzu, so dass nur das Wachstum der Keratinozyten unterstützt wird.

Die Explantationsmethode ist eine einfache und kostengünstige Technik zur Etablierung von Zelllinien, die histolytische, biochemische und biomechanische Eigenschaften aufweisen, die denen in vivo entsprechen. Daher ist diese Methode in der Zell- und Molekularbiologie anerkannt und weit verbreitet. Verwenden Sie die Explantationskultur in Ihrem Labor? Würden Sie sie in Betracht ziehen? Hinterlassen Sie unten einen Kommentar.