Revolutionerende cryo-EM er ved at overtage strukturbiologien

En revolutionerende teknik til bestemmelse af proteiners 3D-form er ved at få et boom. I sidste uge fik en database, der indsamler protein- og andre molekylære strukturer bestemt ved hjælp af kryo-elektronmikroskopi eller cryo-EM, sin 10.000. post.

Indgivelser til Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – et populært arkiv for strukturer, der er løst ved hjælp af elektronmikroskopi – er steget eksponentielt i de seneste år, hovedsagelig på grund af den eksplosive vækst i antallet af cryo-elektronmikroskoper i laboratorier verden over (se “Struktur-sleuths”). EMDB kuraterer strukturer, der er løst med andre mikroskopimetoder, men langt de fleste anvender cryo-EM.

Teknikken indebærer lynfrysning af opløsninger af proteiner eller andre biomolekyler og derefter bombardering af dem med elektroner for at producere mikroskopbilleder af de enkelte molekyler. Disse bruges til at rekonstruere molekylets 3D-form, eller struktur, af molekylet. Sådanne strukturer er nyttige til at afdække, hvordan proteiner fungerer, hvordan de fungerer dårligt i forbindelse med sygdom, og hvordan man kan målrette dem med lægemidler.

I årtier har strukturbiologer foretrukket at anvende røntgenkrystallografi, en teknik, der indebærer, at man krystalliserer proteiner, bombarderer dem med røntgenstråler og rekonstruerer deres form ud fra de afslørende mønstre af bøjet lys, der fremkommer. Røntgenkrystallografi giver strukturer af høj kvalitet, men det er ikke let at bruge den til alle proteiner – nogle kan tage måneder eller år at krystallisere, og andre krystalliserer slet ikke. Kryo-EM kræver ikke proteinkrystaller, men teknikken var forældet, fordi den havde en tendens til at producere strukturer med lav opløsning – nogle forskere kaldte det blobologi.

Billedet er perfekt

Gennembrud inden for hardware og software i 2012-13 producerede mere følsomme elektronmikroskoper og sofistikeret software til at omdanne de billeder, de optog, til skarpere molekylære strukturer (se ‘Fine detaljer’). Det banede vejen for den nuværende vækst i kryo-EM, siger Sjors Scheres, der er strukturbiolog og specialist i teknikken ved MRC Laboratory of Molecular Biology (LMB) i Cambridge, Storbritannien.

Richard Henderson, der er strukturbiolog ved LMB og deler Nobelprisen i kemi i 2017 for sit arbejde med at udvikle teknikken, siger, at selv efter disse fremskridt var væksten langsom i begyndelsen, fordi kun et lille antal laboratorier havde adgang til udstyret. Men da de begyndte at bruge cryo-EM til at fremstille detaljerede kort over molekyler som f.eks. ribosomer – cellernes maskiner til fremstilling af proteiner – fik andre forskere samt deres institutioner og bidragsydere hurtigt øje på dem. “Alle de mennesker, der havde investeret i andre ting og truffet de forkerte beslutninger, tog det dem et år at indhente det,” siger Henderson.

Han anslår, at der i 2024 vil blive bestemt flere proteinstrukturer ved hjælp af cryo-EM end ved hjælp af røntgenkrystallografi. Kryo-EM har allerede fortrængt røntgenkrystallografi for en kategori af proteiner, som forskerne er særligt interesserede i – nemlig dem, der er indlejret i cellemembraner. Mange af disse membranbundne proteiner er involveret i sygdomme og tjener som mål for lægemidler.

Forskudt billeddannelse

Strukturerne af molekyler, der bestemmes ved hjælp af cryo-EM, bliver også mere detaljerede takket være fortsatte forbedringer af hardware og software, siger Scheres.

I første omgang var de skarpeste cryo-EM-strukturer af meget stabile proteiner, der blev brugt til at teste teknologiens grænser. Men Scheres har bemærket, at forskerne i stigende grad opnår meget højopløselige strukturer af medicinsk vigtige molekyler som f.eks. celle-membranproteiner, selv om de har en tendens til at flyde rundt.

“Vi er nu nået til det punkt, hvor de nemme prøver er klaret, og folk kigger på mere komplekse problemer”, siger Ardan Patwardhan, der er strukturbiolog ved European Molecular Biology Laboratory-European Bioinformatics Institute i Hinxton, Storbritannien, og som leder det hold, der driver EMDB.

Henderson forventer, at boomet i cryo-EM-strukturer på et tidspunkt vil aftage. En faktor, der kan bremse væksten, siger han, er de høje omkostninger ved de mest kraftfulde mikroskoper, som kan overstige 5 millioner pund (7 millioner USD). De koster også tusindvis af pund hver dag at drive, og de kræver specialiserede laboratorier, der minimerer vibrationer. Henderson fører kampagne for at overbevise firmaer om at udvikle billigere, men stadig brugbare mikroskoper, som kunne udbrede teknikken endnu mere. “I øjeblikket kan man ikke gå galt i byen ved at investere mere i cryo-EM,” siger han.