Hvad, hvorfor og hvordan man dyrker explantatkultur

Hvad er explantatkultur, og hvorfor skal jeg bruge det?

Explantatkultur er dyrkning af små stykker væv, der er fjernet kirurgisk fra dyrevæv eller -organ. Det er en nyttig metode af flere grunde.

2. Bevarelsen af cellernes histotypiske arkitektur og biokemiske egenskaber betyder, at den mere ligner vævet in vivo end etablerede cellelinjer.
3. Explantatvæv bevarer deres egne cytokiner og vækstfaktorer, hvilket betyder, at proliferationen er mindre stressende og mere biologisk relevant.
4. Celler, der migrerer fra eksplantatet, er i molekylær kommunikation med eksplantatets ledsageceller, hvilket giver afgørende biokemiske og biomekaniske signaler, der er afgørende for vævsmorfogenese, differentiering og homøostase.

Hvornår kan jeg bruge denne metode?

Eksplantekultur anvendes til at etablere en række cellelinjer fra forskellige kilder, herunder pattedyr, gnavere og fugle. Da kulturerne i højere grad ligner cellernes in vivo-situation, er denne teknik nyttig til en lang række anvendelser, herunder til opnåelse af stamceller, kræftforskning, genteknologi, vaccineproduktion, lægemiddelscreening og toksikologiske test.

Hvordan udfører jeg en eksplantkultur?

Hentning af eksplant

En eksplant kan opnås kirurgisk ved hjælp af sterilt udstyr fra pattedyr, gnavere eller fugleorganer eller -væv. F.eks. kan et stykke tandkødsvæv efter tandudtrækning fjernes som en eksplantat for at etablere humane tandkødsfibroblaster, eller et stykke fedtvæv kan bruges til at etablere mesenkymale stamceller.

Skær og rens eksplantatet

Når du har fået dit væv, er det tid til at skære og rense det. Du vil først placere det i en petriskål, der indeholder ca. 1-2 mL ufuldstændigt medium (medium uden serum). Derefter kan du ved hjælp af en skarp kirurgisk kniv skære det (normalt omkring 1×1 mm store stykker). Saml stykkerne af eksplantatet op ved hjælp af en steril pincet og vask forsigtigt. Vaskning kan ske ved at overføre stykkerne til et centrifugerør, der indeholder ca. 0,5 ml ufuldstændigt medium. Bland forsigtigt ved at pipettere mediet 4 til 5 gange, og lad stykkerne sætte sig og fjerne det øverste medium. Dette kan gentages 2 eller 3 gange.

Kulturering af explanterne

Disse opnåede explanter anbringes aseptisk på en belagt overflade og får lov til at sætte sig fast på overfladen i nærvær af et rigt kulturmedium. Dette er normalt basal minimalt medie, Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) eller Minimum Essential Medium Eagle (MEM) suppleret med 10-15% serum. Eksploranterne dyrkes derefter under standardvævskulturbetingelser (pH 7,2-7,4, temperatur 37 °C, 5 % CO2 og luftfugtighed) for at give mulighed for cellevandring og proliferation.

Det er nødvendigt at skifte mediet hver 3. dag uden at forstyrre eksploranterne. Afhængigt af vævets sundhed og alder kommer cellerne ud af eksplantatet inden for 15-30 dage. Når der begynder at vokse celler ud af eksplantatet, skal du tilsætte 5 ml medium til kolben i de efterfølgende dage.

Subkultur og etablering af cellelinje

Når eksplantaterne er helt omgivet af cellerne, kan du trypsinisere cellerne og subkultivere dem. Det er bedre at bruge en lavere koncentration af trypsin (f.eks. <0,25 % trypsin i 5 min). Vælg en passende størrelse kolbe til udsåning, afhængigt af det samlede antal celler, der opnås.

Udfordringer ved eksplantkultur

Selv om eksplantater er gode at bruge, er der et par forhindringer, som du skal overvinde, før du arbejder med dem. De vigtigste udfordringer er:

• Cellerne tager tid om at komme ud af eksplantatet, og derfor kan etableringen af en cellelinje tage omkring en måned
• Muligheden for eksplantatbåren kontaminering
• Generering af heterogene celler eller en blandet population af celler.

Men bare rolig, her er et par enkle tips til at overvinde disse problemer.

Youngere celler vokser hurtigere

Hvis du ønsker at få dine celler hurtigere (inden for 15 dage), skal du sørge for at indsamle eksplantatet fra en sund og yngre donor. Da yngre celler deler sig og vokser hurtigere, bevarer de også deres karakteristiske vækst in vitro, så chancerne for at få cellerne hurtigt fra eksplantatet er meget store.

Undgå kontaminering

Den eksplantatbårne kontaminering kan undgås ved at dyppe vævsstykket i en povidon-iodopløsning i 2 til 3 minutter. Det resterende povidon-jod-restprodukt fjernes ved at skylle eksplantatet i fosfatbufferet saltvand (pH 7,4). Du kan derefter placere eksplantatet i minimalt ufuldstændigt medium og udskille hårdt eller dødt væv, hvis der er noget.

Opnåelse af en homogen cellepopulation fra en heterogen

I eksplantatkultur observeres der normalt heterogene celler i de tidlige passager. For at overvinde dette problem skal du anvende din viden om morfologi og vækstmønsteret hos de celler, du er interesseret i, til at løse dette problem. I tilfælde af eksplantatkultur af gingivalt væv kommer spindelformede gingivale fibroblastceller først frem fra eksplantatet, før der kommer gingivale keratinocytceller frem.

Gingival keratinocytter har en oval til brostensformet morfologi og begynder at dukke op en uge efter, at fibroblastcellerne er kommet ud af eksplantatet, og vokser over fibroblastcellemonolaget (figur 1).

Figur 1. Formering af humane gingivale fibroblastceller med keratinocytter, der lige er kommet frem fra gingivalt eksplorativt væv

Hvis målet er at etablere en gingival fibroblastcellelinje fra gingivalt væv, skal man lade kolben blive konfluent med fibroblastceller og derefter straks subkultivere den. Da keratinocytcellerne er færre i antal, forsvinder de i de efterfølgende 3 til 4 passager (figur 2).

Figur 2. Et monolag af humane gingivale fibroblastceller

Hvis målet er at etablere keratinocytceller fra gingival explant, skal fibroblastcellerne skrabes ud og keratinocytspecifikt medium tilsættes kolben, så kun keratinocytvækst understøttes.

Explantmetoden er en enkel og omkostningseffektiv teknik, der anvendes til at etablere cellelinjer, der har. histolytiske, biokemiske og biomekaniske egenskaber svarende til in vivo. Derfor er denne metode accepteret og anvendes i vid udstrækning inden for celle- og molekylærbiologi. Bruger du eksplantatkultur i dit laboratorium? Ville du overveje det? Efterlad en kommentar nedenfor.