Revoluční kryoEM ovládne strukturní biologii

Převratná technika pro určování 3D tvaru proteinů zažívá boom. Minulý týden získala databáze, která shromažďuje proteinové a jiné molekulární struktury určené pomocí kryoelektronové mikroskopie neboli kryoEM, svůj 10 000. záznam.

Příspěvků do Electron Microscopy Data Bank (EMDB) – populárního úložiště struktur vyřešených pomocí elektronové mikroskopie – v posledních letech exponenciálně přibývá, zejména díky explozivnímu nárůstu počtu kryoelektronových mikroskopů v laboratořích po celém světě (viz „Structure sleuths“). EMDB kurátoruje struktury vyřešené jinými mikroskopickými metodami, ale naprostá většina z nich využívá kryoEM.

Tato technika spočívá v bleskovém zmrazení roztoků proteinů nebo jiných biomolekul a jejich následném bombardování elektrony za účelem vytvoření mikroskopických snímků jednotlivých molekul. Ty se používají k rekonstrukci 3D tvaru nebo struktury molekuly. Takové struktury jsou užitečné pro odhalení toho, jak proteiny fungují, jak selhávají při nemocech a jak na ně zacílit léky.

Po desetiletí dávali strukturní biologové přednost použití rentgenové krystalografie, což je technika, která zahrnuje krystalizaci proteinů, jejich bombardování rentgenovým zářením a rekonstrukci jejich tvaru z výsledných obrazců difraktovaného světla. Rentgenová krystalografie vytváří vysoce kvalitní struktury, ale není snadné ji použít u všech proteinů – krystalizace některých může trvat měsíce nebo roky a jiné nekrystalizují vůbec. KryoEM nevyžaduje krystaly bílkovin, ale tato technika skomírala, protože měla tendenci vytvářet struktury s nízkým rozlišením – někteří vědci ji nazývali blobologie.

Obrázek dokonalý

Přelom v hardwaru a softwaru v letech 2012-13 přinesl citlivější elektronové mikroskopy a sofistikovaný software pro transformaci jimi pořízených obrazů do ostřejších molekulárních struktur (viz „Jemné detaily“). To připravilo půdu pro současný rozvoj kryoEM, říká Sjors Scheres, strukturní biolog a specialista na tuto techniku z Laboratoře molekulární biologie MRC (LMB) v britské Cambridgi.

Richard Henderson, strukturní biolog z LMB, který se v roce 2017 podílel na Nobelově ceně za chemii za svou práci na vývoji této techniky, říká, že i po těchto pokrocích byl růst zpočátku pomalý, protože k vybavení mělo přístup jen malé množství laboratoří. Když však začali používat kryoEM k vytváření podrobných map molekul, jako je ribozom – stroj na tvorbu bílkovin v buňkách -, ostatní vědci, stejně jako jejich instituce a sponzoři, si toho rychle všimli. „Všem lidem, kteří investovali do jiných věcí a udělali špatná rozhodnutí, trvalo rok, než je dohnali,“ říká Henderson.

Odhaduje, že do roku 2024 bude pomocí kryoEM určeno více proteinových struktur než pomocí rentgenové krystalografie. KryoEM již vytlačila rentgenovou krystalografii u jedné kategorie proteinů, která vědce obzvláště zajímá – u proteinů zabudovaných v buněčných membránách. Mnoho takových membránových proteinů se podílí na vzniku nemocí a slouží jako cíle pro léky.

Pokročilé zobrazování

Struktury molekul určované pomocí kryoEM jsou také stále podrobnější díky neustálému zdokonalování hardwaru a softwaru, říká Scheres.

Zpočátku byly nejostřejšími strukturami kryoEM vysoce stabilní proteiny, které se používaly k testování hranic této technologie. Scheres si však všiml, že vědci stále častěji získávají struktury s velmi vysokým rozlišením lékařsky důležitých molekul, jako jsou proteiny buněčných membrán, přestože mají tendenci se třepit.

„Nyní se dostáváme do bodu, kdy jsou snadné vzorky hotové a lidé se zabývají složitějšími problémy,“ říká Ardan Patwardhan, strukturní biolog z Evropské molekulárně biologické laboratoře – Evropského bioinformatického institutu v Hinxtonu ve Velké Británii, který vede tým, jenž řídí EMDB.

Henderson očekává, že boom kryoEM struktur se v určitém okamžiku zpomalí. Jedním z faktorů, který by mohl růst utlumit, je podle něj vysoká cena nejvýkonnějších mikroskopů, která může přesáhnout 5 milionů liber (7 milionů USD). Jejich provoz také stojí tisíce liber denně a vyžaduje specializované laboratoře, které minimalizují vibrace. Henderson se snaží přesvědčit firmy, aby vyvinuly levnější, ale stále užitečné mikroskopy, které by mohly tuto techniku ještě více rozšířit. „V současné době nemůžete udělat chybu, když do kryoEM vložíte více investic,“ říká.