Co, proč a jak s explantátovou kulturou

Co je explantátová kultura a proč bych ji měl používat?

Explantátová kultura je kultivace malých kousků tkáně chirurgicky odebraných ze zvířecí tkáně nebo orgánu. Je to užitečná metoda z několika důvodů.

1. Zachování histotypové architektury a biochemických vlastností buněk znamená, že se více podobá tkáni in vivo než zavedené buněčné linie.
2. Explantátové tkáně si zachovávají vlastní cytokiny a růstové faktory, což znamená, že proliferace je méně stresující a biologicky relevantnější.
3. Buňky migrující z explantátu jsou v molekulární komunikaci s doprovodnými buňkami explantátu, což poskytuje zásadní biochemické a biomechanické signály, které jsou nezbytné pro morfogenezi, diferenciaci a homeostázu tkání.

Kdy mohu tuto metodu použít?

Explantátové kultury se používají při vytváření různých buněčných linií z různých zdrojů včetně savců, hlodavců a ptáků. Protože se kultury více podobají situaci buněk in vivo, je tato technika užitečná v široké škále aplikací včetně získávání kmenových buněk, výzkumu rakoviny, genetického inženýrství, výroby vakcín, screeningu léčiv a toxikologických testů.

Jak provést explantátovou kulturu?

Získání explantátu

Explantát lze získat chirurgicky pomocí sterilního vybavení ze savců, hlodavců nebo ptačích orgánů či tkání. Například kousek dásňové tkáně po extrakci zubu lze odebrat jako explantát pro stanovení lidských dásňových fibroblastů nebo kousek tukové tkáně lze použít pro stanovení mezenchymálních kmenových buněk.

Řezání a čištění explantátu

Jakmile jste získali tkáň, je čas ji rozřezat a vyčistit. Nejprve ji chcete umístit do Petriho misky obsahující asi 1-2 ml neúplného média (médium bez séra). Poté ji můžete pomocí ostrého chirurgického nože nařezat (obvykle na kousky o velikosti asi 1 × 1 mm). Kousky explantátu seberte pomocí sterilních kleští a jemně omyjte. Promývání lze provést přenesením kousků do centrifugační zkumavky obsahující asi 0,5 ml neúplného média. Jemně promíchejte pipetováním média 4 až 5krát a nechte kousky usadit a odstraňte horní část média. Tento postup lze opakovat 2 až 3krát.

Kultivace explantátů

Takto získané explantáty se asepticky umístí na potažený povrch a nechají se přichytit k povrchu v přítomnosti bohatého kultivačního média. Obvykle se jedná o základní minimální médium, Dulbeccovo modifikované médium Eagle (DMEM) nebo minimální esenciální médium Eagle (MEM) doplněné 10-15 % séra. Explantáty se pak kultivují ve standardních podmínkách tkáňové kultury (pH 7,2-7,4, teplota 37 °C, 5 % CO2 a vlhkost), aby se umožnila migrace a proliferace buněk.

Médium je třeba měnit každé 3 dny, aniž by se explantáty narušily. V závislosti na zdravotním stavu a stáří tkáně se buňky z explantátu vynoří během 15-30 dnů. Jakmile začnou z explantátu vyrůstat buňky, přidejte v následujících dnech do baňky 5 ml média.

Subkultivace a založení buněčné linie

Po úplném obklopení explantátů buňkami můžete buňky trypsinizovat a subkultivovat. Je lepší použít nižší koncentraci trypsinu (např. <0,25 % trypsinu po dobu 5 min). Zvolte vhodnou velikost baňky pro výsev v závislosti na celkovém počtu získaných buněk.

Problémy při kultivaci explantátů

Ačkoli se explantáty skvěle používají, existuje několik překážek, které musíte před prací s nimi překonat. Hlavními problémy jsou:

• buňkám trvá nějakou dobu, než se vynoří z explantátu, proto může vytvoření buněčné linie trvat přibližně měsíc
• možnost kontaminace z explantátu
• generace heterogenních buněk nebo smíšené populace buněk.

Ale nebojte se, zde je několik jednoduchých tipů, jak tyto problémy překonat.

Mladší buňky rostou rychleji

Pokud chcete získat buňky rychleji (do 15 dnů), ujistěte se, že explantát odebíráte od zdravého a mladšího dárce. Protože se mladší buňky dělí a rostou rychleji, zachovávají si svůj charakteristický růst i in vitro, takže šance na rychlé získání buněk z explantátu je velmi vysoká.

Vyhněte se kontaminaci

Kontaminaci explantátu lze zabránit ponořením kousku tkáně do roztoku povidon-jodu na 2 až 3 minuty. Zbytky povidon-jodu odstraňte opláchnutím explantátu ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,4). Poté můžete explantát umístit do minimálního nekompletního média a oddělit tvrdé nebo odumřelé tkáně, pokud nějaké jsou.

Získání homogenní buněčné populace z heterogenní

Obvykle jsou v explantátové kultuře pozorovány heterogenní buňky v časných pasážích. K překonání tohoto problému použijte své znalosti morfologie a způsobu růstu buněk, které vás zajímají. V případě explantátové kultury dásňové tkáně se z explantátu nejprve objeví vřetenovité buňky dásňových fibroblastů, a teprve poté se objeví buňky dásňových keratinocytů.

Gingivální keratinocyty mají oválnou až dlaždicovou morfologii, začínají se objevovat týden poté, co se z explantátu vynoří fibroblastové buňky. a rostou nad monovrstvou fibroblastových buněk (Obrázek 1).

Obrázek 1. Rozmnožování lidských gingiválních fibroblastových buněk keratinocyty právě vyrůstajícími z gingivální explantátové tkáně

Pokud je cílem vytvořit buněčnou linii gingiválních fibroblastů z gingivální tkáně, nechte baňku konfluentní s fibroblastovými buňkami a poté ji okamžitě subkultivujte. Protože keratinocytárních buněk je méně, zmizí v následujících 3 až 4 pasážích (Obrázek 2).

Obr. 2. Monovrstva buněk lidských gingiválních fibroblastů

Pokud je cílem vytvořit keratinocytární buňky z gingiválního explantátu, vyškrábněte fibroblastové buňky a přidejte do baňky médium specifické pro keratinocyty, aby byl podporován pouze růst keratinocytů.

Explantační metoda je jednoduchá a nákladově efektivní technika používaná k vytvoření buněčných linií, které mají. histolytické, biochemické a biomechanické vlastnosti podobné jako in vivo. Proto je tato metoda akceptována a široce používána v buněčné a molekulární biologii. Používáte ve své laboratoři explantátové kultury? Uvažovali byste o ní? Zanechte komentář níže.

.