U.S. Food and Drug Administration

Bakteriologisches Analysehandbuch (BAM) Hauptseite

Autoren: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett und Jennifer M. Hait

Überarbeitungsgeschichte:

• Juni 2017 – Neues Kapitel 13B wurde dem Bacteriological Analytical Manual hinzugefügt
• Januar 2018 – Hyperlink für CDC APHIS/CDC Form 4 korrigiert

Staphylococcal food poisoning (SFP) ist eine Vergiftung, die durch den Verzehr von Lebensmitteln entsteht, die mit ausreichenden Mengen an präformierten Enterotoxinen kontaminiert sind. Die Symptome der SFP treten innerhalb von 2-8 Stunden nach der Nahrungsaufnahme auf und umfassen Übelkeit, Erbrechen, Bauchkrämpfe mit oder ohne Durchfall, die normalerweise innerhalb von 24-48 Stunden abklingen. (Argudin et al., 2010). Die Zahl der von SFP betroffenen Personen ist aufgrund von Fehldiagnosen und kleineren Ausbrüchen, die nicht gemeldet werden, nur eine Schätzung. Krankenhausaufenthalte sind selten, wurden aber bei immungeschwächten Menschen, insbesondere bei älteren und sehr jungen Menschen, beobachtet (Scallan et al., 2011).

Staphylokokken sind normalerweise auf der menschlichen Haut und den Schleimhäuten vorhanden, wobei etwa 20-30 % der Menschen persistent und 60 % intermittierend besiedelt sind (Kluytmans et al., 2005). Lebensmittelhandwerker, die mit enterotoxischen Staphylokokken kolonisiert sind, gelten als Hauptquelle für die Kontamination von Lebensmitteln durch direkten Kontakt mit den Produkten oder Kontaktflächen. Auch Tiere wie Milchkühe können Staphylokokken in sich tragen und eine Kontaminationsquelle für Milch und Milchprodukte darstellen. Schließlich können in der Umwelt vorhandene Staphylokokken auf Lebensmittel übertragen werden und als potenzielle Kontaminationsquelle dienen (Gutiérrez et al., 2012).

Zu den Lebensmitteln, die häufig mit SFP in Verbindung gebracht werden, gehören verarbeitete Lebensmittel, Fleisch, Geflügel, Milchprodukte und Backwaren. Sobald das Lebensmittel kontaminiert ist, kann es zum Wachstum von Staphylokokken und zur Produktion von Enterotoxinen kommen, insbesondere wenn keine guten Herstellungsbedingungen eingehalten werden, die das Wachstum verhindern, wie z. B. gekühlte Lagerungsbedingungen oder hitzeabtötende Schritte wie Pasteurisierung (Gutiérrez et al., 2012). Staphylokokken-Enterotoxine sind hitzestabil und werden nicht denaturiert, es sei denn, sie werden über einen längeren Zeitraum hohen Temperaturen ausgesetzt, d. h., Autoklavieren bei 121°C (250°F) bei 15 PSI für 60 Minuten (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus wird am häufigsten mit Ausbrüchen von Staphylokokken-Lebensmittelvergiftungen in Verbindung gebracht, aber auch andere enterotoxigene koagulasepositive Staphylokokken wie S. hyicus und S. intermedius wurden in Ausbrüche verwickelt (Hennekinne et al., 2010). Staphylokokken-Enterotoxine (SEs) sind pyrogene Exotoxine mit superantigener Aktivität. Enterotoxine sind kugelförmige Proteine, die gegen Hitze und Proteasen resistent sind und eine durchschnittliche Molekülgröße von etwa 25 kDa aufweisen. Die Schätzungen für die Menge an Toxin, die erforderlich ist, um eine Krankheit auszulösen, sind sehr niedrig. Bei einem Ausbruch im Zusammenhang mit Schokoladenmilch wurde eine SEA-Konzentration von 0,5ng/ml festgestellt (Evenson et al., 1988), und bei einem Ausbruch im Zusammenhang mit Milchpulver wurden 0,38ng/ml SEA nachgewiesen (Asao, et al., 2003).

Klassische SEs (SEA-SEE) und nicht-klassische SEs, SEG, SEH, SEI, SER und SET haben nachweislich eine Brechreizaktivität. Für die SE-ähnlichen Enterotoxine SElJ-SElQ, SElS, SElU und SElV ist die Brechreizaktivität noch nicht nachgewiesen worden. Alle Se- und Sel-Gene wurden auf mobilen genetischen Elementen wie Bakteriophagen, Pathogenitätsinseln, Plasmiden oder Transposons lokalisiert (Argudin et al., 2012).

Der Nachweis von SEs ist für die Lebensmittelsicherheit und den Schutz der Lebensmittelversorgung von größter Bedeutung. SE-Nachweisverfahren stützen sich auf handelsübliche polyvalente enzymgekoppelte Immunoassays (ELISA) oder enzymgekoppelte fluoreszierende Immunoassays (EFLA) mit Antikörpern, die SEA-SEE nachweisen. Monovalente Methoden sind spezifisch für SEA-SEE und können zur Unterscheidung dieser Typen verwendet werden. Die Methoden erfordern eine Extraktion des Enterotoxins aus dem verdächtigen Lebensmittel vor der Analyse. Die Sensitivität und Selektivität der Methode wird durch eine Dialysekonzentration des Lebensmittelextrakts verbessert, aber aus Zeitgründen kann ein Vortest ohne Konzentration erforderlich sein. Die Dialysekonzentration sollte jedoch bei allen Milchprodukten vor der Analyse durchgeführt werden (Hennekinne et al., 2012).

ACHTUNG: Staphylokokken-Enterotoxine sind hochgiftig und Verfahren, bei denen Aerosole entstehen können, sollten in einer zugelassenen biologischen Sicherheitswerkbank (BSC) durchgeführt werden. Staphylokokken-Enterotoxine (SEA, SEB, SEC, SED und SEE) sind Selektionsstoffe. Die Wissenschaftler müssen die von der CDC aufgestellten Richtlinien befolgen: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

1. Spezielle Ausrüstung und Materialien
   1. Temperaturkontrollierter Raum oder Kühlschrank 2-8°C.
   2. Mixer oder Homogenisator.
   3. Inkubator 35-37°C.
   4. Analysenwaage und Wägeschiffchen.
   5. Waagschale für Dialyse.
   6. pH-Meter. Der pH-Wert während der Extraktion und der pH-Wert der bei der Extraktion verwendeten Puffer sind wichtig. Nehmen Sie Anpassungen innerhalb von ± 0,1 pH-Einheiten vor.
   7. Kühlzentrifuge 2-8°C.
   8. Laborgeräte aus Glas oder Polypropylen, um die Adsorption von Toxinen zu vermeiden.
   9. Filtertuch zum Auffangen von Trümmern nach der Zentrifugation. Oft werden mehrere Lagen vorgenässtes grobes Käsetuch verwendet, um diese Aufgabe zu erfüllen.
   10. Teiltrichter.
   11. Dialysemembran MWCO 6.000-8.000 Dalton (z.B. Spectra/Por® mit Verschlüssen) flache Breite 23 ± 2 mm.
   12. Vakuumkonische Röhrenfiltrationsgeräte (0,22µm-Membran) wie Steriflip (EMD Millipore) werden zur Filtration von flüssigen Kulturüberständen als Sicherheitsmaßnahme zur Vermeidung der Aerosolisierung von Enterotoxinen empfohlen.
   13. Biologische Sicherheitswerkbank.
2. Reagenzien

   Hinweis: Kit-Hersteller können unterschiedliche Puffer oder Lösungsmittel verlangen.

   1. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS-Lösung) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) Zur Herstellung von 1L PBS lösen Sie 9 g NaCl und 3,58 g Na2HPO4 in 1L destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,2 ± 0,2 ein.
   2. Natriumchlorid (NaCl).
   3. Natriumphosphat (Na2HPO4).
   4. Polyethylenglykol (PEG) (20.000 mol wt) Bereiten Sie eine 30%ige (w/v) PEG-Lösung vor, indem Sie 30 g PEG pro 70 ml destilliertes Wasser hinzufügen.
   5. 1 N (oder 0,1 N) NaOH.
   6. 1 N (oder 0,1 N) HCl.
3. Vorbereitung der Dialysemembran
   Schneiden Sie die Dialysemembran lang genug, um den zu konzentrierenden Nahrungsmittelextrakt aufzunehmen. Den Schlauch 2 Mal in destilliertem Wasser einweichen, um den Glycerinbelag zu entfernen. Einen Membranverschluss verwenden oder ein Ende des Schlauchs mit 2 Knoten zusammenbinden. Füllen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser und prüfen Sie, ob er undicht ist, indem Sie den gefüllten Beutel zusammendrücken, während Sie das offene Ende fest verschlossen halten. Entleeren Sie den Beutel und legen Sie ihn bis zur Verwendung in destilliertes Wasser.
4. Extraktion von Enterotoxin aus Lebensmittelportionen

   HINWEIS: Dieses Verfahren und andere Verfahren, bei denen Aerosole von pathogenen Mikroorganismen oder Enterotoxinen entstehen können, sollten in einer zugelassenen Biosicherheitskabine durchgeführt werden.

   1. Wenn möglich, zerkleinern Sie das gesamte Lebensmittelprodukt oder Portionen von repräsentativen Teilen des Produkts in einem Mixer, um die Probe zu homogenisieren, so dass jegliches SE im Lebensmittel gleichmäßig verteilt wird.
      1. Für Käse mit Rinde, nehmen Sie eine Käseprobe mit 10% Rinde und 90% Käse.
      2. Für getrocknete Produkte, verwenden Sie gleiche Mengen Wasser mit dem Produkt zu mischen oder folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
   2. Wiegen Sie 25 g der Probe in einem Glasbecher und übertragen Sie die Testportion in einen Mixer mit 40 ml destilliertem Wasser und mischen Sie bei hoher Geschwindigkeit für 3 Minuten erzeugen eine homogenisierte Aufschlämmung. Fügen Sie flüssigen Proben kein Wasser hinzu, sondern fahren Sie mit Schritt 3 fort.
   3. Lassen Sie das Toxin diffundieren, indem Sie die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur schütteln.
   4. Säuern Sie die Mischung mit 0,1 N HCl auf einen pH-Wert zwischen 3,5 und 4,0 an. Hinweis: Sinkt der pH-Wert unter 3,0, muss eine weitere 25-g-Portion hergestellt werden.
   5. Die angesäuerte Aufschlämmung in konische 50-ml-Propylenröhrchen überführen. Bei 3.130 × g für 20 min bei 5°C zentrifugieren. Niedrigere Geschwindigkeiten mit längerer Zentrifugierzeit können verwendet werden, aber die Abtrennung einiger Lebensmittel ist nicht so effektiv. Die Abtrennung von fetthaltigen Stoffen ist unwirksam, es sei denn, die Lebensmittel werden bei gekühlter Temperatur zentrifugiert.
   6. Den Überstand durch ein Seihtuch oder ein anderes geeignetes Filtermaterial, das sich in einem Scheidetrichter befindet, in ein 800-ml-Becherglas ablassen. Wenn der Überstand nicht klar ist, zentrifugiere erneut und dekantiere die Flüssigkeit durch das Seihtuch. Testen Sie den pH-Wert, der zwischen 3,5 und 4,5 liegen sollte. Wenn der pH-Wert korrekt ist, neutralisieren Sie die Mischung mit 0,1 N NaOH, um einen pH-Wert zwischen 7,4 und 7,6 zu erhalten.
   7. Wenn der pH-Wert >4,5 ist, wiederholen Sie die Ansäuerung, aber wenn <3,0 oder=““>9,0 wiederholen Sie den Vorgang mit einer weiteren 25 g Lebensmittelportion.
   8. Soweit eine ausreichende Probe für die Wiederholungsuntersuchung zur Verfügung steht, kann ein Aliquot für das Screening mit einem validierten Assay entnommen werden (siehe Abschnitt H). Sind die Screening-Ergebnisse negativ, muss der verbleibende Extrakt durch Dialyse konzentriert und erneut getestet werden.
5. Konzentration des Extrakts durch Dialyse
   1. Extrakt in vorbereiteten Dialysebeutel geben. Den geschlossenen Beutel in eine Schale legen und den Beutel in 30% (w/v) PEG eintauchen. Bei 5°C halten, bis das Volumen auf 15-20 ml oder weniger reduziert ist. Dieser Vorgang kann 24-72 Stunden dauern. Wenn sich das Volumen nach der Lagerung über Nacht nicht verringert hat, ist der Schale pulverisiertes PEG hinzuzufügen. Entfernen Sie den Beutel aus dem PEG und waschen Sie die Außenseite gründlich mit Wasser ab, um eventuell am Beutel haftendes PEG zu entfernen. 1-2 Minuten lang in destilliertem Wasser einweichen. Den Inhalt in ein kleines Becherglas gießen.
   2. Das Innere des Beutels mit 2-3 ml destilliertem Wasser (PBS wird für Milch und Milchprodukte verwendet) spülen, indem man mit den Fingern außen am Beutel auf und ab fährt, um Material zu entfernen, das an den Seiten des Schlauches haftet. Wiederholen Sie die Spülung, bis das Rinsat klar ist. Das Volumen so klein wie möglich halten.
   3. Den pH-Wert des Extrakts auf 7,4-7,6 einstellen.
   4. Konzentrierte Extrakte sollten innerhalb von 48 Stunden analysiert und bei 3-5°C gelagert werden, andernfalls die Extrakte bei 18-20°C einfrieren und vor dem Testen bei 3-5°C vollständig auftauen. Einige Assays wie der Vidas SET2 erfordern eine sofortige Analyse.
6. Testen von SE aus Bakterienkulturen

   Staphylococcenstämme, die im Verdacht stehen, Enterotoxine zu produzieren, können in Nährbouillon wie TSB oder BHI vorangereichert werden.

   1. Transferieren Sie zwei oder drei morphologisch ähnliche Kolonien auf 10 ml Nährbouillon.
   2. Über Nacht bei 35-37°C auf einem Orbitalschüttler inkubieren.
   3. Kulturen 5 Minuten bei 10°C 3500 × g zentrifugieren
   4. Den Überstand mit einem Steri-Flip-Vakuumfiltergerät mit einem 0,22µm-Filter oder einem anderen geschlossenen System filtern, um eine Aerosolisierung von Enterotoxinen zu vermeiden. Dieses Verfahren muss in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sicherheit des Wissenschaftlers zu gewährleisten.
   5. Kulturüberstände können hohe SE-Konzentrationen aufweisen, die außerhalb des linearen Bereichs des Kits liegen und eine Verdünnung mit PBS erfordern.
7. Ergebnismeldung

   Das Vorhandensein von Staphylokokken-Enterotoxin, das in Lebensmitteln nachgewiesen wird, ist dem Federal Select Agent Program zu melden, das vom Center for Disease Control and Protection (CDC) verwaltet wird: https://www.selectagents.gov/form4.html durch Ausfüllen des APHIS/CDC-Formulars 4.

   Positive Ergebnisse sind als Staphylokokken-Enterotoxin in × g (ml) des Produkts nachgewiesen zu melden. Negative Ergebnisse sind als Staphylokokken-Enterotoxin nicht nachgewiesen in × g (ml) Produkt anzugeben.

8. Anmerkungen

   Der Testkit muss Enterotoxin bei einem Mindestwert von 0,05ng/g mit hoher relativer Empfindlichkeit (>90%) und relativer Spezifität (>90%) nachweisen können.

   Die Erwähnung von Markennamen oder kommerziellen Produkten in der Methode dient ausschließlich der wissenschaftlichen Information und stellt keine Empfehlung oder Befürwortung durch die U.S. Food and Drug Administration dar. Zwei Methoden, die üblicherweise für den SE-Nachweis verwendet werden, sind das von der AOAC zugelassene Vidas SET2 (bioMerieux, Inc), ein automatisierter polyvalenter, enzymgekoppelter Fluoreszenztest (EFLA), der SEA-SEE nachweist (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010). Die aktuelle Katalognummer für Vidas Set2 ist Ref. 30705. Der Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) ist ein manueller enzymgekoppelter Immunoassay, der in mit polyvalenten Antikörpern beschichteten Vertiefungen durchgeführt wird. Der polyvalente Ridascreen-Kit weist die Staphylokokken-Enterotoxine SEA-SEE nach und wurde durch Ringversuche und Validierungsstudien Dritter unter der Leitung des Referenzlabors der Europäischen Union für koagulasepositive Staphylokokken für die vom Europäischen Komitee für Normung (CEN) vorgeschlagene ISO-Norm 19020 validiert und verifiziert. Ein monovalentes Kit Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) ist verfügbar, aber dieses Kit wurde nicht durch eine dritte Partei validiert. Die Katalognummer für das polyvalente Set Total ist R4105 (96 Tests) oder R4106 (48 Tests). Die Katalognummer für den monovalenten SET A,B,C,D,E-Kit ist R4101.

Interferenzen

Nicht-spezifische Reaktionen können bei Lebensmitteln auftreten, die endogene Enzyme wie Laktoperoxidase oder alkalische Phosphatase enthalten und mit Kits wie Vidas SET2 interferieren, der alkalische Phosphatase als Nachweisenzym verwendet (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Es wird empfohlen, alle positiven Ergebnisse mit einer alternativen Methode zu bestätigen, die ein anderes Nachweisenzym verwendet. Im Falle des Vidas SET2 ist eine alternative Methode der Ridascreen SET Total, der Laktoperoxidase verwendet.

Eine Wärmebehandlung kann wie folgt durchgeführt werden, um die endogene alkalische Phosphatase aus der Probe zu entfernen:

• 600 μL des konzentrierten Extrakts in ein Röhrchen überführen
• 2 Minuten lang auf 80°C erhitzen
• Den Vidas SET2-Test mit dem abgekühlten Konzentrat wiederholen. Es kann zu einem gewissen Verlust von Enterotoxin kommen.

Wenn bei Verwendung des Ridascreen oder eines anderen Kits mit Laktoperoxidase ein ungenaues Ergebnis vermutet wird, 100 μl des konzentrierten Extrakts in ein Röhrchen geben. Jeweils 50 μl der Substrat- und Chromagen-Kit-Lösungen hinzufügen. Mischen und auf eine blau-grüne Färbung achten. Wenn eine blau-grüne Farbe auftritt, ist dies ein Hinweis darauf, dass intrinsische Lactoperoxidase in der Probe vorhanden ist und den Assay stört. Daher muss eine andere Nachweismethode verwendet werden.

1. Argudin, MA, Mendoza, MC, und Rodicio MR. Lebensmittelvergiftungen und Staphylococcus aureus Enterotoxine. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
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