Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Bacteriological Analytical Manual (BAM) Main Page

Författare: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett och Jennifer M. Hait

Revisionshistorik:

  • juni 2017 – Nytt kapitel 13B lades till i Bacteriological Analytical Manual
  • januari 2018 – Hyperlänken till CDC APHIS/CDC Form 4 korrigerad

Stafylokockmatförgiftning (SFP) är en förgiftning till följd av förtäring av livsmedel som är kontaminerade med tillräckliga nivåer av förbildade enterotoxiner. Symtomen på SFP visar sig inom 2-8 timmar efter intag och omfattar illamående, kräkningar, bukkramper med eller utan diarré som vanligtvis försvinner inom 24-48 timmar. (Argudin et al., 2010). Antalet personer som drabbas av SFP är endast en uppskattning på grund av feldiagnoser och mindre utbrott som inte rapporteras. Sjukhusvård är sällsynt, men har noterats hos personer med nedsatt immunförsvar särskilt äldre och mycket unga (Scallan et al., 2011).

Stafylokocker förekommer normalt på människans hud och slemhinnor med cirka 20-30 % för persisterande och 60 % för intermittent kolonisering (Kluytmans et al., 2005). Livsmedelshanterare som är koloniserade med enterotoxigena stafylokocker anses vara den huvudsakliga källan till kontaminering av livsmedel genom direktkontakt med produkterna eller kontaktytor. Djur som mjölkboskap kan också bära på stafylokocker och kan utgöra en smittkälla för mjölk och mjölkprodukter. Slutligen kan stafylokocker som finns i miljön överföras till livsmedelsprodukter som fungerar som en potentiell föroreningskälla (Gutiérrez et al., 2012).

Livsmedel som ofta är kopplade till SFP är bland annat bearbetade livsmedel, kött, fjäderfä, mejeriprodukter och bageriprodukter. När livsmedlet väl är kontaminerat kan stafylokocker växa och enterotoxiner produceras, särskilt om goda tillverkningsvillkor inte följs som förhindrar tillväxt, t.ex. kylda lagringsförhållanden eller värmedödande steg, t.ex. pastörisering (Gutiérrez et al., 2012). Stafylokockers enterotoxiner är värmestabila och denatureras inte om de inte utsätts för höga temperaturer under långa perioder, dvs, autoklav vid 121°C (250°F) vid 15 PSI i 60 minuter (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus är vanligast i samband med utbrott av matförgiftning orsakade av stafylokocker, men andra enterotoxigena koagulaspositiva stafylokocker som S. hyicus och S. intermedius har också varit inblandade i utbrott (Hennekinne et al., 2010). Stafylokockers enterotoxiner (SE) är pyrogena exotoxiner med superantigen aktivitet. Enterotoxiner är globulära proteiner som är resistenta mot värme och proteaser med en molekylstorlek på i genomsnitt cirka 25 kDa. Uppskattningarna av den mängd toxin som krävs för att orsaka sjukdom är mycket låga. I ett utbrott kopplat till chokladmjölk upptäcktes nivåer av SEA på 0,5 ng/ml (Evenson et al., 1988) och 0,38 ng/ml SEA upptäcktes i ett utbrott kopplat till mjölkpulver (Asao, et al., 2003).

Klassiska SEs (SEA-SEE) och icke-klassiska SEs, SEG, SEH, SEI, SER och SET har bevisad emetisk aktivitet. Emetisk aktivitet för SE-liknande enterotoxiner SElJ-SElQ, SElS, SElU och SElV har ännu inte påvisats. Alla se- och sel-gener har lokaliserats till mobila genetiska element, inklusive bakteriofager, patogenitetsöar, plasmider eller transposoner (Argudin et al., 2012).

Detektering av SE är av största vikt för livsmedelssäkerheten och skyddet av livsmedelsförsörjningen. Metoder för detektion av SE bygger på kommersiellt tillgängliga polyvalenta enzymkopplade immunoassays (ELISA) eller enzyme-linked fluorescent immunoassay (EFLA) med antikroppar som detekterar SEA-SEE. Monovalenta metoder är specifika för SEA-SEE och kan användas för att särskilja dessa typer. Metoderna kräver extraktion av enterotoxin från misstänkt livsmedel före analys. Metodens känslighet och selektivitet förbättras om livsmedelsextraktet koncentreras genom dialys, men av tidsskäl kan det vara nödvändigt att göra preliminära tester utan koncentration. Dialyskoncentration bör dock utföras på alla mejeriprodukter före analys (Hennekinne et al., 2012).

VARNING: Stafylokock enterotoxiner är mycket giftiga och förfaranden som kan skapa aerosoler bör utföras i godkänt biologiskt säkerhetsskåp (BSC). Stafylokock enterotoxiner (SEA, SEB, SEC, SED och SEE) är selektiva agenser. Forskare måste följa de riktlinjer som fastställts av CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Särskild utrustning och material
    1. Temperaturkontrollerat rum eller kylskåp 2-8°C.
    2. Blender eller homogenisator.
    3. Inkubator 35-37°C.
    4. Analytisk våg och vågbåtar.
    5. Bricka för dialys.
    6. PH-mätare. pH-värdet under extraktionen och pH-värdet i de buffertar som används vid extraktionen är viktiga. Gör justeringar inom ± 0,1 pH-enhet.
    7. Kylda centrifuger 2-8°C.
    8. Laboratorieartiklar i glas eller polypropylen för att undvika toxinadsorption.
    9. Filterduk används för att samla upp skräp efter centrifugering. Ofta används flera lager förvättad grov ostduk för att utföra denna uppgift.
    10. Separtyrtratt.
    11. Dialysmembran MWCO 6 000-8 000 dalton (t.ex. Spectra/Por® med förslutningar) platt bredd 23 ± 2 mm.
    12. Vakuumfiltreringsanordningar för koniska rör (0,22 µm membran), t.ex. Steriflip (EMD Millipore), rekommenderas för filtrering av supernatanter från flytande kulturer som en säkerhetsåtgärd för att undvika aerosolisering av enterotoxiner.
    13. Biologiskt säkerhetsskåp.
  2. Reagenser

    Anmärkning: Kitttillverkare kan kräva olika buffertar eller lösningsmedel.

    1. Fosfatbuffrad saltlösning (PBS-lösning) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) För att bereda 1 l PBS löses 9 g NaCl och 3,58 g Na2HPO4 i 1 l destillerat vatten. Justera pH till 7,2 ± 0,2 med HCl.
    2. Natriumklorid (NaCl).
    3. Natriumfosfat (Na2HPO4).
    4. Polyetylenglykol (PEG) (20 000 mol wt) Bered en 30 % (w/v) PEG-lösning genom att tillsätta 30 g PEG för varje 70 ml destillerat vatten.
    5. 1 N (eller 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (eller 0,1 N) HCl.
  3. Förberedelse av dialysmembran
    Skär dialysmembranet tillräckligt långt för att rymma det livsmedelsextrakt som ska koncentreras. Blötlägg slangarna i 2 byten destillerat vatten för att avlägsna glycerolbeläggningen. Använd en membranförslutning eller knyt den ena änden av slangen med två knutar nära varandra. Fyll röret med destillerat vatten och testa om det läcker genom att klämma ihop den fyllda säcken samtidigt som den öppna änden hålls ordentligt stängd. Töm säcken och placera den i destillerat vatten tills den används.
  4. Extraktion av enterotoxin från matportion

    OBS: Detta förfarande och andra förfaranden som kan generera aerosoler av patogena mikroorganismer eller enterotoxiner bör utföras i ett godkänt biosäkerhetsskåp.

    1. Om möjligt, mal hela livsmedelsprodukten eller portioner från representativa urval av produkten i en mixer för att homogenisera provet så att eventuellt förekommande SE i livsmedlet fördelas jämnt.
      1. För ostar med skorpa, ta ostprov med 10 % skorpa och 90 % ost.
      2. För torkade produkter, använd lika mycket vatten med produkten för att blanda eller följ tillverkarens anvisningar.
    2. Väga upp 25 g av provet i en glasbägare och överför testportionen till en mixer med 40 ml destillerat vatten och mixa i hög hastighet i 3 minuter för att generera en homogeniserad slam. Tillsätt inte vatten till flytande prov utan fortsätt till steg 3.
    3. Låt toxinet diffundera genom att skaka provet i rumstemperatur i 30 minuter.
    4. Ansyra blandningen med 0,1N HCl till ett pH mellan 3,5 och 4,0. Observera: Om pH sjunker under 3,0 måste ytterligare en 25 g-portion förberedas.
    5. Överför den försurade uppslamningen till koniska propylenrör på 50 ml. Centrifugera vid 3 130 × g i 20 minuter vid 5 °C. Lägre hastigheter med längre centrifugeringstid kan användas, men rensningen av vissa livsmedel är inte lika effektiv. Avskiljning av fettämnen är ineffektiv om inte livsmedlet centrifugeras vid kyld temperatur.
    6. Dekantera supernatantvätskan i 800 ml bägare genom ostduk eller annat lämpligt filtreringsmaterial som placeras i en separeringstratt. Om supernatanten inte är klar, centrifugera igen och dekantera vätskan genom ostduken. Testa pH-värdet som bör ligga mellan 3,5 och 4,5. Om pH är korrekt, neutralisera blandningen med 0,1N NaOH för att få ett pH mellan 7,4 och 7,6.
    7. Om pH är >4,5 upprepa syrning, men om <3,0 eller=””>9,0 upprepa processen med ytterligare en 25 g matportion.
    8. Förutsatt att det finns tillräckligt med prov tillgängligt för upprepad testning kan en alikvot tas ut för screening med en validerad analys (se avsnitt H). Om screeningresultaten är negativa måste det återstående extraktet koncentreras med dialys och testas på nytt.
  5. Dialys koncentration av extraktet
    1. Placera extraktet i en förberedd dialyssäck. Lägg den stängda säcken ner i en bricka och dränk säcken i 30 % (w/v) PEG. Förvara vid 5 °C tills volymen har minskat till 15-20 ml eller mindre. Denna process kan ta 24-72 timmar, men om volymen inte har minskat efter att ha legat kvar över natten, tillsätt pulveriserat PEG till brickan. Ta bort säcken från PEG och tvätta utsidan noggrant med vatten för att avlägsna all PEG som fastnar på säcken. Blötlägg i destillerat vatten i 1-2 minuter. Häll innehållet i en liten bägare.
    2. Skölj insidan av säcken med 2-3 ml destillerat vatten (PBS används för mjölk och mejeriprodukter) genom att köra fingrarna upp och ner på utsidan av säcken för att avlägsna material som fastnar på slangens sidor. Upprepa sköljningen tills sköljvattnet är klart. Håll volymen så liten som möjligt.
    3. Justera pH i extraktet till 7,4-7,6.
    4. Koncentrerade extrakt bör analyseras inom 48 timmar och förvaras vid 3-5°C, annars frys extrakten vid 18-20°C och tina helt vid 3-5°C före testning. Vissa analyser, t.ex. Vidas SET2, kräver omedelbar analys.
  6. Testning av SE från bakteriekulturer

    Stafylokockstammar som misstänks producera enterotoxiner kan föranrikas i näringsbuljong, t.ex. TSB eller BHI.

    1. Överför två eller tre morfologiskt likartade kolonier till 10 mL näringsbuljong.
    2. Inkubera 35-37°C över natten på en omrörare.
    3. Kentrifugera kulturerna 5 minuter 3500 × g vid 10°C
    4. Filtrera supernatanten med hjälp av en Steri-Flip vakuumfiltreringsanordning med ett 0,22 µm-filter eller ett annat slutet system för att undvika aerosolisering av enterotoxiner. Denna procedur måste utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp för att garantera forskarens säkerhet.
    5. Kulturens supernatant kan ha höga nivåer av SE som ligger utanför kitets linjära intervall kan kräva utspädning med PBS.
  7. Rapportering av resultat

    Närvaron av stafylokock enterotoxiner som påvisas i livsmedelsprodukter ska rapporteras till det federala programmet för selektiva agens som förvaltas av Center for Disease Control and Protection (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html genom att fylla i APHIS/CDC Form 4.

    Positiva resultat skall rapporteras som Staphylococcal entertoxoin upptäckt i × g (ml) produkt. Negativa resultat skall rapporteras som Staphylococcal enterotoxin ej påvisat i × g (ml) produkt.

  8. Anmärkningar

    Kitet skall kunna påvisa enterotoxin på en lägsta nivå av 0,05ng/g med hög relativ känslighet (>90%) och relativ specificitet (>90%).

    Omnämnandet av handelsnamn eller kommersiella produkter i metoden är endast avsett för vetenskaplig information och innebär inte att den amerikanska livsmedels- och läkemedelsmyndigheten rekommenderar eller godkänner den. Två metoder som vanligen används för SE-detektion är den AOAC-godkända Vidas SET2 (bioMerieux, Inc) som är en automatiserad polyvalent enzyme linked fluorescent assay (EFLA) som detekterar SEA-SEE (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010). Det nuvarande katalognumret för Vidas Set2 är Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) är en manuell enzymkopplad immunoanalys som utförs i brunnar belagda med polyvalenta antikroppar. Det polyvalenta Ridascreen-kitet upptäcker stafylokockentreotoxiner SEA-SEE och har validerats och verifierats genom grundliga ringförsök och valideringsstudier av tredje part under ledning av Europeiska unionens referenslaboratorium för koagulaspositiva stafylokocker för det av Europeiska standardiseringskommittén (CEN) föreslagna mandatet för ISO-standard 19020. Ett monovalent kit Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) finns tillgängligt, men detta kit har inte validerats av tredje part. Katalognumret för det polyvalenta setet Set Total är R4105 (96 tester) eller R4106 (48 tester) . Katalognumret för SET A,B,C,D,E monovalent kit är R4101.

Interferenser

Ospecifika reaktioner kan förekomma i livsmedelsprodukter som har endogena enzymer som laktoperoxidas eller alkaliskt fosfatas och interfererar med kit som Vidas SET2 som använder alkaliskt fosfatas som detektionsenzym (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Det rekommenderas att alla positiva resultat bekräftas med en alternativ metod som använder ett annat detektionsenzym. När det gäller Vidas SET2 är en alternativ metod Ridascreen SET Total som använder laktoperoxidas.

En värmebehandling kan tillämpas för att avlägsna endogent alkaliskt fosfatas från provet enligt följande:

  • Överför 600 μl koncentrerat extrakt till ett rör
  • Värma upp till 80 °C i 2 minuter
  • Upprepa Vidas SET2-analysen med det kylda koncentratet. En viss förlust av enterotoxin kan förekomma.

Om felaktigt resultat misstänks med Ridascreen eller annat kit som använder laktoperoxidas, överför 100 μl koncentrerat extrakt till ett rör. Tillsätt 50 μl vardera av substrat- och kromagenkitlösningar. Blanda och observera för en blågrön färg. Om blågrön färg uppträder är det ett tecken på att intrinsiskt laktoperoxidas finns i provet och stört analysen. En annan detektionsmetod måste därför användas.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC och Rodicio MR. Livsmedelsförgiftning och Staphylococcus aureus enterotoxiner. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B och Rodicio MR. Genotyper, innehåll av exotoxingener och antimikrobiell resistens hos stammar av Staphylococcus aureus från livsmedel och personer som hanterar livsmedel. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H och Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimate of of entertoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska laboratorier. Femte upplagan, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Uppskattning av den humana dosen av stafylokock enterotoxin A från ett stort utbrott av stafylokockförgiftning i samband med chokladmjölk. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ och Garcia, P. Incidence of Staphylococcus aureus and Analysis of Associated Bacterial Communities on Food Industry Surfaces. AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL och Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, and Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, and Wertheim, HFL. Nasalt bärarskap av Staphylococcus aureus och förebyggande av nosokomiala infektioner. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C. och Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

Leave a Reply