Neutrofil diapedesis:

Ett av de klassiska kännetecknen för inflammation är infiltration av den drabbade vävnaden av polymorfonukleära leukocyter (PMN). För att detta ska kunna ske måste cirkulerande PMN genomgå adhesiva interaktioner med endotelet som gör det möjligt för dem att aktiveras, plattas till och emigrera över endotelfodret i mikrokärlen. De molekylära bestämningsfaktorerna för dessa adhesiva interaktioner har studerats ingående, och det finns ett allmänt samförstånd om den sekvens av händelser som leder till att PMN placeras i ett läge där de kan emigrera in i vävnaden (3, 12). Initialt uppstår en svag adhesiv interaktion mellan cirkulerande PMN och endotelet som resulterar i en saltatorisk rörelse av PMN längs endotelet, ett fenomen som kallas rullning. Genom att rulla kan PMN ligga nära endotelet, och om det finns lokalt genererade inflammatoriska mediatorer aktiveras PMN. När de väl är aktiverade bildar PMN starkare adhesiva interaktioner med endotelet, vilket leder till att de stannar upp. Därefter emigrerar PMN över endotelet. Till skillnad från de inledande adhesiva interaktionerna (rullning och adhesion), där det råder allmän enighet om vilka mekanismer som är inblandade, vet man inte mycket om de mekanismer som är inblandade i PMN:s transendoteliska migration. Till och med den grundläggande förutsättningen om huruvida PMN emigrerar mellan endotelceller (paracellulär väg) eller genom de egentliga endotelcellerna (transcellulär väg) är kontroversiell.

Den rådande konsensus är att cirkulerande PMN emigrerar från det intravaskulära kompartmentet till interstitium genom att passera mellan intilliggande endotelceller, dvs. genom att använda en paracellulär väg (11). I både in vivo- och in vitro-studier med elektron- och ljusmikroskopi har man fångat migrerande PMN som sträcker ut pseudopoder mellan endotelceller för att passera genom endotelbarriären som svar på en kemotaktisk gradient. För att PMN ska kunna använda den paracellulära vägen för transendotelisk migration måste den adhesiva kopplingen mellan intilliggande endotelceller brytas och endotelcellerna måste separera från varandra tillräckligt mycket för att PMN ska kunna passera. Många inflammatoriska mediatorer som används för att simulera inflammation in vitro kan i sig själva framkalla bildandet av luckor i odlade endotelcellsmonolager, dvs. endotelcellsretraktion. Eftersom stora klyftor mellan endotelceller sällan observeras i in vivo-modeller av inflammation, kan detta fenomen dock vara en överdriven effekt av inflammatoriska mediatorer i in vitro-system. Odlade endotelmonolager har underutvecklade interendoteliella adhesionsförbindelser jämfört med deras motsvarigheter in vivo, och därför kan inflammatoriska mediatorer lättare producera endotelcellsretraktion in vitro än in vivo (12). Korrelatet in vivo till detta fenomen är ett ökat makromolekylärt läckage över interendoteliella korsningar som observeras som svar på inflammatoriska mediatorer. Tillsammans ger in vitro-studierna trovärdighet åt idén att endotelceller kan separera från varandra som svar på inflammatoriska mediatorer, även om separationens omfattning kan vara överdriven.

Eviden om att PMN kan inducera endotelcellsretraktion härrör i första hand från in vitro-studier som har behandlat de mekanismer som är inblandade i PMN-medierad endotelcellsskada (12). Denna skada var av icke-lytisk karaktär och visade sig som att endotelceller lossnade från monolager som odlades på icke-porösa ytor. Denna avlossning av endotelcellerna inträffade 3-6 timmar efter det att aktiverade PMN lagts på ytan av endotelcellsmonolager och har hänförts till elastas som härrör från PMN. Eftersom lossnade endotelceller sällan observeras i in vivo-modeller av inflammation verkar PMN-medierad endotelcellsavlossning också vara en överdrift av en in vivo-händelse på grund av de experimentella förhållanden som råder in vitro. I dessa system (endotelmonolager som odlas på icke-porösa ytor) tillåts inte PMN att transmigrera och röra sig bort från endotelcellmonolaget. De förblir således i nära anslutning till endotelcellerna och fortsätter att proteolytiskt förvärra monolaget, vilket så småningom leder till att endotelcellerna dras tillbaka och därefter lossnar. Om de aktiverade PMN tillåts migrera över endotelcellmonolager observeras sällan en grov endotelcellsretraktion och -avlossning.

PMN-deriverat elastas kan inducera endotelcellsretraktion och -avlossning i monolager. Detta är analogt med användningen av proteaser för att expandera endotelceller, dvs. de proteasbehandlade cellerna drar sig tillbaka och lossnar från substratet, men efter behandling med proteashämmare kan de återigen sättas ut och fortsätta att växa normalt. Intressant nog kan både indragning av endotelceller och PMN:s transendoteliska migration förhindras av proteashämmare (t.ex. elastashämmare). Dessa senare observationer tyder på att PMN använder endogent elastas för att inducera endotelcellsretraktion av tillräcklig omfattning för att de skall kunna passera mellan intilliggande endotelceller utan att skada dem. Nya studier tyder på att elastasmedierad PMN-migration genom endotel är en starkt reglerad process som inte kräver PMN-degranulering (3). De aktiverade PMN utsöndrar inte elastas i den extracellulära miljön, utan mobiliserar elastas till membranet och lokaliserar det till den migrerande fronten, t.ex. de pseudopodier som tränger in mellan angränsande endotelceller. Att PMN-degranulering inte är nödvändig för deras transendoteliella migration stöds ytterligare av observationen att PMN-cytoplaster (anukleära PMN utan granuler) migrerar genom endotelmonolager som svar på en kemotaktisk gradient lika effektivt som normala PMN. Återigen kan cytoplasternas transendoteliska migration förhindras av elastashämmare.

Endotelceller hålls samman av adhesionsförbindelser som består av transmembranproteiner (11). För att neutrofiler ska kunna passera mellan endotelcellerna måste därför de adhesiva interaktionerna i dessa junktioner brytas. Det finns två adhesionsförbindelser som är relevanta för PMN:s transendoteliella migration: adherensförbindelser och tight junctions. Adherens junctions består av vascular-endothelial (VE)-cadherin/cateninkomplex. VE-cadherin har en extracellulär domän som interagerar homotypiskt med VE-cadherin på angränsande endotelceller. VE-cadherins cytoplasmatiska domän associerar med intracellulära β- eller γ-cateniner. Dessa VE-cadherin/cateninkomplex är kopplade till aktincytoskelettet via α-catenin (fig. 1A). Täta korsningar består av flera transmembranproteiner, inklusive occludin och claudins 1 och 2, och associerade intracellulära proteiner, som ZO-1, -2 och -3, som förbinder de täta korsningsproteinerna med cytoskelettet. Av dessa två adhesionsförbindelser är det effekten av PMN:s transendoteliala migration på adherensförbindelserna som har fått mest uppmärksamhet.

Nyligen genomförda studier med hjälp av konfokalmikroskopi tyder på att PMN:s adhesiva interaktioner (adhesion och transendotelial migration) kan resultera i lokal störning av adherensjunktionsproteinerna (10). Två populationer av PMN fångades när de adhererade till monolager av endotelceller: 1) de under vilka det inte fanns någon störning av kontinuiteten i adherens junction-proteinerna och 2) de under vilka det fanns en störning av adherens junction-proteinerna. Störningen av kontinuiteten i adherensjunkterna genom adherenta PMN var ett lokalt fenomen, eftersom adherensjunkterna längre bort från PMN inte påverkades. En systematisk analys visade att adherens junction-proteiner under adherenta PMN påverkades i tur och ordning, dvs. β-catenin försvann före VE-cadherin. PMN som fångades i samband med transendothelial migration var undantagslöst förknippade med förlust av alla adherens junction-proteiner på migrationsstället. Återigen fanns det ingen effekt på adherens junction-integriteten på platser som låg längre bort från de migrerande PMN. Dessutom finns det bevis för betydelsen av störningar i adherens junctions vid PMN:s transendoteliella migration, bland annat följande: 1) in vivo ökade antikroppar mot VE-cadherin PMN:s emigration, och 2) in vitro ökade antikroppar mot VE-cadherin PMN:s transendoteliska migration och inducerade en reorganisering av endoteliala aktincytoskelettet, vilket resulterade i bildandet av klyftor mellan endotelcellerna.

Med avseende på tight junction-komplex har man i nyligen genomförda studier gjort liknande observationer. PMN:s transendoteliska migration störde ZO-1- och -2-kontinuiteten endast på den plats där PMN tränger in i de interendoteliska junkterna (1). Utbredda diskontinuiteter i tight junctions noterades inte.

Potentiella mekanismer som är involverade i paracellulär diapedesis

Mekanismen genom vilken adhesiva interaktioner mellan PMN och endotelceller stör adherensjunktionen är oklar. En möjlighet är att adherenta PMN använder endogena proteaser för att bryta ned adherens junction-proteiner (Fig. 1A). Till exempel kunde elastashämmare minska omfattningen av den PMN-inducerade förlusten av adherens junction-proteinerna VE-cadherin och β-catenin (2). Andra studier (11) visar att aktiverade PMN kan bryta ned VE-cadherin och att en elastashämmare kan förhindra denna nedbrytning. Dessutom producerar renat neutrofilt elastas nedbrytningsprodukter av VE-cadherin som liknar dem som noterats efter nedbrytning av denna adherens junction-komponent av aktiverade PMN. Sammantaget verkar det troligt att PMN-avledd elastas spelar en roll i nedbrytningen av adherens junction.

PMN-endotelcells adhesiva interaktioner skulle också kunna signalera till endotelcellerna att aktivt delta i PMN:s transendoteliala migration genom att separera från varandra, det vill säga bildning av interendoteliala klyftor (fig. 1A). Detta påstående stöds av följande bevis. Adherenta PMN kan inducera ökningar i endotelcellernas Ca2+-nivåer, och chelatering av detta Ca2+ resulterar i en hämning av PMN:s transendoteliella migration. Dessutom minskar inhibering av endotelial myosin light-chain kinase (en nyckelfaktor för bildandet av interendoteliala cellgap) PMN:s transendoteliala migration (11). Slutligen, som påpekats ovan, påverkar adherenta PMN det intracellulära β-cateninet före det plasmamembranöverskridande VE-cadherinet. Tillsammans tyder dessa observationer på att endotelceller kan fås att aktivt delta i PMN:s transendoteliella migration genom att dra sig tillbaka från varandra.

Evidens till förmån för transcellulär diapedesis

Många tidiga och nyare rapporter som undersökt leukocytdiapedesis in vivo med hjälp av ett ultrastrukturellt tillvägagångssätt tyder på att majoriteten av PMN:erna lämnar vaskulaturen transcellulärt, dvs, genom porer eller passager som går genom den endoteliska cytoplasman. Undersökning av seriella sektioner med hjälp av transmissionselektronmikroskopi tyder på att PMN kan migrera genom områden som inte är förknippade med identifierbara cellcellsgränser (4, 5, 8). Det har hävdats att inte ens seriella sektioner ger ett entydigt bevis för att det inte fanns en cellcellsövergång i närheten, utan snarare att den kan ha missats. Dessutom kan det vara svårt att identifiera elektrontäta adherensjunktioner, särskilt i de områden där endotelet är <0,5 μm högt. Slutligen visar nya in vitro-data att cell-cell adherens junctions molekylärt sönderdelas under PMN diapedesis (10), och därför skulle man inte förvänta sig att se dem morfologiskt.

Bilder från svepande elektronmikroskopi ger mer övertygande bevis för att PMN tränger in i endotelceller genom öppningar som inte är förknippade med endotelcellernas cell-cellkontakter (4, 9). PMN som håller på att diapedesera verkar ha en hantelform, med en förträngning i området i nivå med endotelet (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Beroende på hur långt diapedesen har framskridit kan man se en bubbelliknande förlängning som antingen sticker ut i kärllumen eller sträcker sig in i interstitium (5, 9, 11, 15). Detta tyder på att leukocyterna pressas genom en cirkulär por med en liten, begränsad diameter snarare än att enskilda endotelceller dras tillbaka från varandra. Endotelcellen och leukocyten förblir i nära kontakt under hela diapedesen. Endotelet tycks ofta sprida sig längs PMN-ytans luminalsida för att helt uppsluka den och på så sätt stänga den luminala spalten innan PMN släpps ut i vävnadsmatrisen (4, 5, 8). Denna process har ofta observerats under emigration in vivo, men har inte visats uppträda under transendothelial migration in vitro.

Potentiella mekanismer som är involverade i transcellulär diapedesis

Och även om det är svårt att tillämpa strikta mekanistiska tillvägagångssätt i in vivo-studier finns det tillräckliga indicier som stödjer flera möjliga mekanismer genom vilka PMN emigrerar transcellulärt. Det är tänkbart att de transcellulära porerna genom vilka PMN migrerar är ett resultat av proteolytisk skada på endotelet. Det har dock påpekats att endotelet, åtminstone ultrastrukturellt sett, förblir oskadat och fortsätter att bilda caveolae och endocytotiska vesiklar även i membranregioner som är i nära kontakt med PMN (13). Det är mer troligt att PMN, som verkar migrera korta sträckor längs den apikala endotelytan, söker sig till tunna områden av endotelet, t.ex. fenestrae. Fenestrae kan vara öppnade (50 nm i diameter) eller vara omslutna av ett membran som är lika tjockt som två plasmamembran (utan cytoplasma). PMN kan således lätt passera genom öppnade fenestrae eller proteolytiskt passera genom fenestrae med diafragma utan att skada det egentliga endotelet. Fenestrae kan utgöra en viktig väg för PMN-emigration i de organ som innehåller fenestrerade mikrokärl (t.ex. gastrointestinala slemhinnor, sekretoriska körtlar).

I organ som innehåller kontinuerliga mikrokärl (t.ex. hud, muskler) kan PMN använda caveolae eller pinocytotiska vesiklar och sätta in filopoder i dem för att penetrera endotelbarriären. Dessa strukturer, med en diameter på mellan 50 och 100 nm, tros förmedla proteintransport genom endotelet och utgör en extrajunktiv väg för vaskulärt proteinläckage under inflammation. Nyligen har det visat sig att caveolae bildar vesikulo-vakuolära organeller, som kan bilda små kontinuerliga membranbundna passager genom cytoplasman i en endotelcell (6). Det har visats att bildandet av sådana caveolae och vesiklar fortsätter i områden av endotelytans membran som är i kontakt med vidhäftande PMN:er (13). Dessutom sträcker PMN:er som fäster tätt vid endotelcellens yta ofta ut fingerliknande filopoder i fördjupningar i det apikala plasmamembranet och omformar på så sätt endotelytan (4, 7, 8). Den utskjutande kraften från en vidhäftande filopodium i bildande vesikulo-vakuolära organeller kan leda till att detta filopodium uppstår på den abluminala endotelsidan (fig. 1B), där det lätt kan interagera med den extracellulära matrisen och breda ut sig längs den (fig. 1B).

En koncentration av F-aktin och mikrofilament i ledande pseudopodier av PMN har påvisats under diapedesis in vivo (15) och in vitro (3) och kan generera den kraft som krävs för att dra framryckande cellprocesser längs med genom de transcellulära porerna. Porerna kan vidgas till en storlek på 3-5 μm, genom vilka leukocyten lätt kan passera. Denna utvidgning av den inledande vakuolära porten kan delvis åstadkommas av krafter som genereras av spänningar i det kortikala mikrofilamentsystemet som finns i den sfäriska delen av leukocyten som fortfarande sticker ut i kärlets lumen. Faktum är att en koncentration av F-actin i den kaudala regionen av transmigrerande PMN har observerats under sena stadier av diapedesis (15). Dessutom kan cytoskeletala omarrangemang i den endoteliala cytoplasman hjälpa till att vidga den transendoteliala poran, vilket tidigare har föreslagits (14). Processen för porbildning skulle åtföljas av en spridning av apikala endotelmembranregioner längs PMN-cellytan, vilket leder till att de luminala PMN-delarna slutligen uppslukas av endotelet, vilket har visats i elektronmikrografer (fig. 1B). Detta aktiva deltagande av endotelet skulle bidra till en snabb återförslutning av endotelfodret och därmed begränsa proteinläckaget.

Sammanfattning

Utifrån denna genomgång av bevisen är det uppenbart att PMN kan använda sig av både paracellulära och transcellulära vägar för att ta sig igenom endotelbarriären under inflammation. Det är värt att påpeka att PMN:s transendoteliska migration in vitro gynnar den paracellulära vägen, medan PMN:s transendoteliska migration in vivo gynnar den transcellulära vägen. Om man teleologiskt antar att den transmigrerande PMN kommer att välja den väg som ger minst motstånd, kan det finnas en förklaring till den uppenbara diskrepansen mellan de resultat som erhållits med hjälp av in vitro- och in vivo-metoder.

I endotelcellmonolager som odlas i kultur är de mest försvagade regionerna nära cell-cell-övergångarna, och det är därför inte förvånande att detta är den plats som föredras där diapedesis inträffar. I odlade endotelceller är dessutom de intercellulära korsningarna instabila strukturer som ständigt demonteras och återmonteras. Ett sådant område skulle vara lättillgängligt för pseudopodier från transmigrerande leukocyter. Det finns också bevis för att även in vitro är den paracellulära väg som används av PMN under diapedesis specifikt vald, dvs. diapedesis sker företrädesvis vid tricellulära hörn snarare än mellan två endotelceller (1). Adherens- och tight junctions är diskontinuerliga vid dessa tricellulära hörn och utgör därmed den minsta motståndets väg för det transmigrerande PMN. Däremot är interendoteliala korsningar mycket bättre utvecklade in vivo och är mer motståndskraftiga mot proteinförflyttning över dem. Därför kan PMN föredra att använda porer i endotelcellernas tunna område, t.ex. fenestrae eller caveolae, som vägen för minsta motstånd.

Att tillskriva den preferentiella väg (paracellulär vs. transcellulär) som används av PMN under diapedesis till om man använt in vitro- eller in vivo-metoder för att studera detta fenomen är framför allt en överdriven förenkling. Det finns många exempel på avvikelser från detta paradigm. Det finns till exempel bevis för att PMN kan använda den paracellulära vägen in vivo och den transcellulära vägen in vitro. Om den transcellulära vägen är den föredragna vägen för PMN-diapedesis in vivo, varför förändras då PMN-diapedesis in vivo dramatiskt genom att man ingriper i jonktionsproteiner? Det kan mycket väl vara så att denna diskussion kommer att bestå i många år framöver, i likhet med diskussionen om huruvida transendoteliala proteinförflyttningar företrädesvis sker via den paracellulära eller den transcellulära vägen. Man kan tänka sig att argumenten om vilken väg PMN:s transendotheliala migration tar kan delvis tillskrivas arten av det inflammatoriska svaret eller arten av den kärlbädd där det sker. Förhoppningsvis kommer ytterligare studier att ge ytterligare information som gör det möjligt att lösa denna kontrovers.

.