Klinisk betydelse av uttryck av cannabinoidreceptorer CB1 och CB2 i maligna och godartade sköldkörtelförändringar hos människor

Abstract

Det endocannabinoida systemet består av cannabinoidreceptorer (CB1 och CB2), Deras endogena ligander (endocannabinoider) och proteiner som ansvarar för deras metabolism deltar i många olika funktioner som är oumbärliga för homeostatisk reglering i flera vävnader och utövar även antitumorigena effekter. Syftet med denna studie var att utvärdera den kliniska betydelsen av CB1- och CB2-uttrycket i godartade och maligna sköldkörtelförändringar hos människor. CB1- och CB2-proteinernas uttryck bedömdes immunohistokemiskt på paraffininbäddade sköldkörtelvävnader från 87 patienter med godartade och maligna lesioner och analyserades statistiskt med klinisk-patologiska parametrar, follikulära cellers proliferationsförmåga och risk för återfallsfrekvens uppskattad enligt American Thyroid Associations (ATA) stadieindelningssystem. Förstärkt CB1- och CB2-uttryck observerades signifikant oftare i maligna jämfört med benigna sköldkörtelförändringar ( och , respektive). Förstärkt CB1- och CB2-uttryck observerades också betydligt oftare i papillära karcinom jämfört med hyperplastiska noduler ( och , resp.). I maligna sköldkörtelförändringar var förhöjt CB2-uttryck signifikant förknippat med förekomsten av lymfkörtelmetastaser . Förhöjt CB2-uttryck observerades också oftare i maligna sköldkörtelfall med förekomst av kapsel- , lymfatisk och vaskulär invasion , liksom hos dem med ökad risk för återfallsfrekvens , dock på en icke-signifikant nivå, medan CB1-uttrycket inte var förknippat med någon av de undersökta klinisk-patologiska parametrarna. Våra data tyder på att CB-receptorer kan vara involverade i malign sköldkörtelomvandling och särskilt CB2-receptorn skulle kunna fungera som användbar biomarkör och potentiellt terapeutiskt mål vid sköldkörtelneoplasi.

1. Introduktion

Endocannabinoidsystemet (ECS) är ett endogent lipidsignalinducerande system som finns i olika mänskliga vävnader och som utövar många olika och orelaterade funktioner. Betydande studier har visat på ECS:s reglerande effekter på det centrala och perifera nervsystemet, mag-tarmkanalen och immunsystemet, som är involverade i flera processer, t.ex. gastrointestinal motilitet, humör, smärtreglering, minne och aptit . Dessa funktioner utlöses genom att endogena och exogena ligander binder sig till cannabinoidreceptorer (CB-receptorer). Förutom dessa välkända funktioner utövar ECS också antiproliferativa effekter genom modulering av flera signalvägar , samtidigt som dess aktivering kan ha prognostisk betydelse för tumörers utvecklingsprogression .

Två undertyper av CB-receptorer finns, med olika fördelning i de mänskliga vävnaderna. CB1-receptorn är huvudsakligen lokaliserad vid det centrala nervsystemet, adipocyter, lever, bukspottkörtel, skelettmuskulatur och T-lymfocyter . CB2-receptorn upptäcks främst i immunceller, men även i neuroner och andra celler som ingår i det centrala nervsystemet såsom astrocyter och mikroglia samt i cerebromikrovaskulära endotelceller . Aktiveringen av CB-receptorer hämmar cAMP-bildningen genom dess koppling till Gi-proteiner, vilket resulterar i minskad proteinkinas A- (PKA-) beroende fosforylering . CB-receptorer kopplas också till extracellulärt signalreglerat kinas (ERK) och specifikt p42/p44 och p38 , som deltar i fosfatidylinositol 3-kinas (PI3K) och ceramidsignalering . Andra receptorer är också knutna till ECS som transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV-1), peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) och icke-CB1/CB2 G-protein-kopplade receptorer GPR55 .

EKS-liganderna är cannabinoiderna, inklusive de bioaktiva komponenterna i Cannabis Sativa, syntetiska CB-mimetiska föreningar och endogena ligander till CB-receptorer . Den viktigaste molekylen i den första kategorin är Δ9-THC, som är välkänd för sina psykoaktiva egenskaper . De andra två kategorierna omfattar syntetiska ligander som för närvarande har utvecklats (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiol, ajuleminsyra, WIN55 212-2) och endocannabinoider som produceras av människokroppen och som är lipidbådande derivat av arakidonsyra (AA) som är konjugerade med antingen etanolamin eller glycerol . De viktigaste av dessa molekyler är anandamid (AEA) och 2-arachidonoylglycerol (2-AG), men ytterligare ämnen har också identifierats, t.ex. O-arachidonoyletanolamin (OAE, virodhamin), 2-arachidonoylglyceroleter (2-AGE, noladineter), N-arachidonoyldopamin (NADA) och palmitoyletanolamid (PEA) . Förutom CB-receptorerna och alla deras ligander omfattar ECS också de viktiga enzymerna för biosyntes, transport och nedbrytning av liganderna .

Förutom ECS-funktioner för att upprätthålla homeostas har den ovan nämnda korsdialogen mellan ECS och de viktigaste onkogena vägarna (MAPK/ERK- och PI3K/Akt-vägen) på senare tid vunnit intresse och har belyst ECS:s betydelse för tumörigenesen . Dessutom har cannabinoider visat sig inducera apoptos i cancerceller, hämma tumörvaskularisering via VEGF-minskning och undertrycka cancercellers invasiva kapacitet . Antiproliferativa effekter råder och flera studier tyder på att cannabinoider har potential som antitumorala medel .

Diagnostik av sköldkörtelskador har nyligen ökat, inte bara på grund av förbättrade diagnostiska tekniker, utan också på grund av att deras verkliga förekomst ökar i befolkningen . Faktum är att sköldkörtelcancer är den vanligaste maligniteten i det endokrina systemet . Även om sköldkörtelcancer vanligtvis botas helt genom kirurgi och terapi dör fortfarande 10-20 % av patienterna på grund av återfall eller tumörutveckling . Det är därför viktigt att fastställa nya behandlingsstrategier och hitta nya prognostiska markörer för att kunna förutsäga det kliniska förloppet för varje patient och anpassa de tillgängliga terapeutiska metoderna därefter. I denna aspekt syftade föreliggande studie till att utvärdera det immunohistokemiska uttrycket av CB1- och CB2-receptorn i godartade och maligna sköldkörtelförändringar i samband med klinisk-patologiska egenskaper som är relaterade till prognosen.

2. Patienter och metoder

2.1. Patienter

Det undersökta materialet bestod av 87 histologiskt undersökta kirurgiska sköldkörtelprover från lika många patienter som hade genomgått sköldkörtelkirurgi för benigna och maligna lesioner. Fyrtiotre godartade (37 hyperplastiska knölar och 6 Hashimoto-thyreoidit) och fyrtiofyra maligna (40 papillära och 4 follikulära karcinom) fall ingick i studien. Varje neoplasm klassificerades enligt WHO:s histologiska klassificering av sköldkörteltumörer . Risken för återfall uppskattades enligt American Thyroid Association (ATA) staging system . Ingen av patienterna hade fått någon form av cancerbehandling före operationen och det fanns ingen klinisk historia av huvud- och halsbestrålning eller annan cancer.

2.2. Immunohistokemi

Immunfärgningar för CB1 och CB2 utfördes på formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadssektioner av sköldkörteln med hjälp av en polyklonal CB1 IgG-antikropp av get (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) och en polyklonal CB2 IgG-antikropp av kanin (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Kortfattat: 4 μm tjocka vävnadssektioner avvaxades i xylen och fördes till vatten genom graderade alkoholer. Antigenhämtning utfördes genom att mikrovågsugga objektglas i 10 mM citratbuffert (pH 6,1) i 15 minuter (min) vid hög effekt, enligt tillverkarens anvisningar. För att avlägsna den endogena peroxidasaktiviteten behandlades sektionerna sedan med nyberedd 0,3 % väteperoxid i metanol i mörker under 30 minuter i rumstemperatur. Ospecifik antikroppsbindning blockerades med Eraser och Sniper, specifika blockeringsreagenser för primära get- respektive kaninantikroppar (Biocare Medical, Concord, Kalifornien, USA), i 5 minuter. Sektionerna inkuberades i 1 timme (h) i rumstemperatur med de primära antikropparna mot CB1 och CB2 utspädda 1:300 respektive 1:200 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) enligt tillverkarens anvisningar. Sektionerna inkuberades sedan i rumstemperatur med biotinylerat länkreagens (Biocare Medical) i 10 minuter, följt av inkubering med peroxidaskonjugerad streptavidinmärkning (Biocare Medical) i 10 minuter. Den resulterande immunperoxidasaktiviteten utvecklades med hjälp av ett DAB-substratkit (Vector Laboratories, Kalifornien, USA) i 10 minuter. Sektionerna kontrafärgades med Harris hematoxylin och monterades i Entellan (Merck, Darmstadt, Tyskland). Lämpliga negativa kontroller utfördes genom att utelämna den primära antikroppen och/eller ersätta den med ett irrelevant antiserum. Som positiv kontroll användes vävnadssektioner av bröst- och skivepitelcancer i rörlig tunga med känt CB1- och CB2-uttryck. De follikulära cellernas proliferativa kapacitet bedömdes genom Ki-67 immunohistokemiskt uttryck, enligt tidigare beskrivning .

2.3. Utvärdering av immunohistokemi

Immunohistokemisk utvärdering utfördes genom att minst 1000 tumörceller räknades i varje fall av två oberoende observatörer (Stamatios Theocharis och Paraskevi Alexandrou) som var blinda för de kliniska uppgifterna, med fullständig observatörsöverensstämmelse. Proverna betraktades som ”positiva” för CB1 och CB2 när mer än 5 % av tumörcellerna i snittet var positivt färgade . Tumörcellernas immunoreaktivitet för CB1 och CB2 poängsattes enligt procentandelen CB1- och CB2-positiva tumörceller som 0: negativ färgning – 0-4 % av tumörcellerna positiva; 1: 5-24 % av tumörcellerna positiva; 2: 25-49 % av tumörcellerna positiva; 3: 50-100 % av tumörcellerna positiva och dess intensitet som 0: negativ färgning, 1: mild färgning; 2: intermediär färgning; 3: intensiv färgning . Slutligen klassificerades uttrycket av CB1 och CB2 som lågt om den totala poängen var 0 eller 2 och högt om den totala poängen var ≥3 . Ki-67-immunoreaktivitet klassificerades enligt procentandelen positivt färgade follikulära celler som översteg det procentuella medianvärdet i två kategorier (under och över medelvärdet), som tidigare rapporterats .

2.4. Statistisk analys

Chi-square-test användes för att bedöma skillnaden i CB1- och CB2-uttryck mellan maligna och benigna sköldkörtelförändringar, samt mellan fall av papillärt karcinom och hyperplastiska noduler. Chi-square-test användes för att bedöma sambanden mellan CB1- och CB2-uttryck och klinikopatologiska egenskaper i undergruppen av patienter med maligna sköldkörtelförändringar. Ett 2-stavigt resultat ansågs vara statistiskt signifikant. Statistiska analyser utfördes med hjälp av programpaketet SPSS för Windows (version 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

3. Resultat

3.1. Klinisk betydelse av CB1-uttryck i mänskliga maligna och godartade sköldkörtelförändringar

CB1-positivitet (IHC-poäng > 0) noterades i 52 (60 %) av 87 sköldkörtelförändringar. Trettioen (36 %) av de 87 undersökta fallen uppvisade hög CB1-immunoreaktivitet (IHC-poäng ≥ 3). Det subcellulära mönstret för CB1-distributionen var övervägande cytoplasmatiskt och ibland membranöst. Normala omgivande områden i anslutning till tumören visade sig vara negativa för CB1. Representativa CB1-immunfärgningar för hyperplastisk nodul och papillärkarcinom visas i figurerna 1 a respektive 1 b. CB1-immunoreaktiviteten var signifikant annorlunda mellan benigna och maligna sköldkörtelförändringar (tabell 1, ). Högt CB1-uttryck observerades signifikant oftare i papillärkarcinom jämfört med hyperplastiska noduli (tabell 1, ). CB1-uttrycket var inte förknippat med patienternas ålder och kön och de follikulära cellernas proliferativa kapacitet. I undergruppen av maligna sköldkörtelförändringar noterades högt CB1-uttryck i 23 (52 %) av 44 fall. Det fanns inget samband mellan CB1-receptoruttryck och tumörstorlek, förekomst av capsulär, vaskulär eller lymfatisk invasion, lymfkörtelmetastasering och follikulära cellers proliferationsförmåga (tabell 2). CB1-receptoruttryck var inte förknippat med risken för återfall uppskattad enligt ATA:s stadieindelningssystem (data inte visad).

(a)

(b)

(c)

(d)

>

(a)
(b)
(c)
(d)

3.2. Klinisk betydelse av CB2-uttryck i mänskliga maligna och godartade sköldkörtelförändringar

CB2-positivitet (IHC-poäng > 0) noterades i 61 (71 %) av 87 sköldkörtelförändringar. Trettiotvå (37 %) av de 87 undersökta fallen uppvisade hög CB2-immunoreaktivitet (IHC-poäng ≥ 3). Det subcellulära fördelningsmönstret var övervägande cytoplasmatiskt och ibland membranöst. Normala omgivande områden i anslutning till tumören visade sig vara negativa för CB2. Representativa CB2-immunfärgningar för hyperplastiska noduler och papillärkarcinom visas i figurerna 1(c) respektive 1(d). Högt CB2-uttryck observerades betydligt oftare i maligna sköldkörtelförändringar jämfört med godartade, liksom i papillärkarcinom jämfört med hyperplastiska noduler (tabell 1 och , respektive). I undergruppen maligna sköldkörtelförändringar noterades högt CB2-uttryck i 24 (55 %) av 44 fall. Högt CB2-uttryck var signifikant förknippat med förekomsten av lymfkörtelmetastaser (tabell 2, ). Högt CB2-uttryck var också förknippat med förekomsten av kapsel-, lymfatisk invasion och vaskulär invasion, dock på en icke-signifikant nivå (tabell 2, , , och , respektive). Inga samband mellan CB2-uttryck och patienternas ålder och kön, tumörstorlek och follikelcellernas proliferationshastighet noterades (tabell 2). Högt CB2-receptoruttryck observerades oftare i maligna sköldkörtelförändringar som uppvisar en ökad risk för återfallsfrekvens enligt ATA:s stadieindelningssystem, dock på en icke-signifikant nivå ().

4. Diskussion

I den aktuella studien var CB1- och CB2-proteinexpressionen förhöjd i maligna jämfört med godartade sköldkörtelförändringar. Vi beskriver också för första gången ett samband mellan CB2-proteinuttryck och klinikopatologiska parametrar som är avgörande för patienternas hantering och prognos. Framför allt var ett ökat CB2-uttryck signifikant förknippat med förekomsten av lymfkörtelmetastaser och gränsdragande med förekomsten av vaskulär invasion, medan indikativa men icke-signifikanta associationer med förekomsten av kapsel- och lymfatisk invasion och uppskattad recidivfrekvens också noterades. Liknande resultat för överexpression av CB1-receptorn erhölls när det gäller maligna jämfört med benigna sköldkörtelförändringar, men icke-signifikanta samband eller tendenser till korrelation mellan CB1-uttryck och klinisk-patologiska parametrar noterades.

I enlighet med de nuvarande resultaten uppreglerades CB-receptorer i vissa maligna tumörer hos människor, inklusive skivepitelcancer i munnen, bukspottkörtelcancer, bukspottkörtel-, hepatocellulärt- och prostatacancer, medan de inte uttrycktes i normala vävnader i dessa organ. Å andra sidan var CB1-receptorn nedreglerad i kolorektalcancer i motsats till intilliggande normala vävnader, vilket pekar på ECS:s olika roller i olika tumörer och indikerar de många interaktionerna mellan ECS och de mekanismer som kontrollerar celltillväxt och proliferation . Dessa mekanismer kan inbegripa direkt induktion av transformerad celldöd, cellcykelstopp och hämning av tumörangiogenes och metastasering . De antitumorala effekterna av ECS har också beskrivits i många studier. I kolorektalcancer kunde endocannabinoider och syntetiska cannabinoider inducera apoptos och hämma karcinogenesen genom mekanismer som involverar både CB-receptorer, TRPV1-kanaler och PPARγ-vägen . Liknande resultat har uppnåtts i studier av bukspottkörtel-, lung- och bröstcancer, kolangiokarcinom och hepatocellulärt karcinom . Synergistiska effekter av cannabinoider med konventionell kemoterapi mot tumörer har också rapporterats .

CB-receptoröveruttryck i sköldkörtelcancer har nyligen rapporterats in vitro . Närmare bestämt inducerade IL-12-stimulering av cellinjer för anaplastiskt sköldkörtelcancer CB2-receptoröveruttryck och ledde till CB2-agonistmedierad apoptos och tumörregression . Dessutom gjorde CB2-uppregleringen tumörcellerna mer mottagliga för behandling med standardkemoterapi . En tänkbar förklaring till detta fenomen var den ceramidberoende aktiveringen av den mitokondriella intrinsiska vägen, som leder till apoptos, och som utlöses av aktivering av CB2-receptorn . En annan studie på cellinjer för sköldkörtelcancer visade att 2-metyl-2′-F-anandamid (Met-F-AEA) hämmade tumörtillväxten, i samband med höga CB1-receptornivåer . Det rikliga CB1-receptoruttrycket noterades i cellinjer som var mer mottagliga för behandling och som därefter var mer mottagliga för tillväxthämning. Sådana resultat tillskrivs p53-aktivering, ökning och minskning av cyklin A, vilket leder till apoptos.

Förutom de möjliga terapeutiska implikationerna när det gäller tumörigenes och ECS, kan detektering av CB-receptorernas överexpression ha potential som prognostiska indikatorer. Uppreglering av båda CB-receptorerna i vävnadsprover av hepatocellulärt karcinom var signifikant förknippad med förbättrad prognos och längre sjukdomsfri överlevnad . Sådana fynd kombinerades med histopatologiska tumöregenskaper, eftersom höga CB-receptornivåer observerades i fall som uppvisade god differentiering och begränsat engagemang i portkanalen . Å andra sidan var CB2-immunoreaktivitet förknippad med kortare sjukdomsfri överlevnad vid skivepitelcancer i huvud och hals . När det gäller CB1-receptorn var dess överexpression förknippad med dåligt patientutfall vid kolorektal-, prostata- och bukspottkörtelcancer . Framför allt var ökat CB1-uttryck hos patienter med kolorektalcancer i stadium IV oberoende av varandra korrelerat med dålig prognos . Ökat CB1-uttryck var också förknippat med aggressivt prostataadenokarcinom med högre Gleason-poäng, större tumörstorlek och ökad cellproliferationshastighet samt metastasering vid diagnosen . Dessutom var lågt CB1-uttryck eller höga FAAH/MAGL-nivåer korrelerade med längre överlevnad och högre smärtstatus. Liknande men inte statistiskt signifikanta resultat för CB2-receptorn noterades . Med hänsyn till ovan nämnda uppgifter verkar de för närvarande tillgängliga studierna om CB-receptornivåer och deras samband med prognos i olika tumörer motsägelsefulla och kan vara nära relaterade till omfattningen av ECS deltagande i tumörigenesen.

5. Slutsats

Förhöjda immunohistokemiska CB1- och CB2-receptoruttrycksnivåer var korrelerade med malignitet i sköldkörteln. Dessutom var förhöjda CB2-uttrycksnivåer förknippade med klinikopatologiska egenskaper som är viktiga för patienternas terapeutiska hantering. Dessa resultat stödde bevis för att CB-receptorer och särskilt CB2-receptorn kan störa molekylära vägar som deltar i malign omvandling av sköldkörteln och skulle kunna betraktas som potentiella terapeutiska mål för att undertrycka tumörutveckling. Större kohortstudier rekommenderas starkt för att bekräfta och fastställa den kliniska användbarheten av CB-receptorer som potentiella prognostiska markörer vid sköldkörtelneoplasier.

Interessentkonflikter

Alla författare intygar att de inte har accepterat någon finansiering eller stöd från en organisation som på något sätt kan vinna eller förlora ekonomiskt på resultaten av denna studie. Alla författare intygar att de inte har varit anställda av en organisation som på något sätt kan vinna eller förlora ekonomiskt på resultaten av denna studie. Ingen av författarna har några andra intressekonflikter.

Författarnas bidrag

Eleftheria Lakiotaki och Constantinos Giaginis har bidragit lika mycket till studien.