Kemisk derivatisering i bioanalys

Användningar

Kemisk derivatisering har länge visat sig vara en analytisk teknik i bioanalys för att övervinna problem som är förknippade med låg joniseringseffektivitet, instabilitet i föreningen, dålig selektivitet eller oacceptabla kromatografiska prestanda (dålig retention, dålig toppform och problem med överföring) och till och med dålig flyktighet för GC-separation. Denna teknik är ett kraftfullt verktyg inom många områden av kemin, bland annat inom medicin, rättsmedicin, livsmedelsvetenskap, dopingkontroll och miljövetenskap. Målet med kemisk derivatisering är att ändra strukturen hos analyten (antingen en nukleofil eller elektrofil) med hjälp av ett kemiskt reagens (antingen en elektrofil eller nukleofil beroende på analytens art) och som ett resultat bildas en ny förening (reaktionens derivat) med förbättrade kemiska och fysikaliska egenskaper för analys. Reaktionsförhållandena (mängden reagens, reaktionstid och temperatur etc.) optimeras så att det önskade derivatet bildas med högsta möjliga reaktionsutbyte. Ytterligare förfaranden för rengöring av prover kan utvecklas för att eliminera oönskade biprodukter och överskottsreagens, vilket minimerar analysavvikelser vid analysen.

Med hjälp av kemisk derivatisering blir det möjligt att analysera det omöjliga. Många exempel på detta har presenterats i litteraturen och påverkar GC-, LC-MS/MS- och NMR-detektion. Det mest anmärkningsvärda har varit den kromatografiska separationen av enantiomerer genom chiral derivatisering med hjälp av specifika upplösande reagenser utan användning av specialiserade chirala kolonner och separationsbetingelser .

Överväganden

Valet av lämpligt kemiskt reagens är viktigt för en lyckad derivatisering och är beroende av den specifika tillämpningen. I allmänhet, om målanalyten är en nukleofil (förening med ett överskott av elektroner), väljs en elektrofil (föreningar med total elektronbrist) som reagens, och vice versa. Reagenserna måste vara selektiva (riktade mot en specifik plats i molekylen) för att undvika derivatisering på flera platser i målmolekylen, metaboliter eller endogena komponenter. För en molekyl som innehåller både hydroxyl- och aminofunktionella grupper bör man t.ex. undvika att använda syraklorider eller anhydrider som derivatiseringsreagenser, eftersom dessa kommer att derivatisera båda funktionella grupperna. Däremot är användningen av dansylklorid som derivatiseringsreagens lämplig för amino- och fenolfunktionella grupper eftersom den inte reagerar med alifatiska alkoholer. Andra krav som måste beaktas vid valet av reagens är tillgänglighet (kommersiellt), renhet och kostnad. Typiskt sett är kostnaden för reagenser minimal och utgör därför inget hinder för användning.

Med optimerade förhållanden är kemiska derivatiseringsförfaranden typiskt sett tillräckligt robusta för att kunna användas för farmaceutisk bioanalys, och de kan uppfylla förväntningarna i lagstiftningen. Detta visas vanligtvis under en rigorös valideringsprocess där flera parametrar, inklusive men inte begränsat till, noggrannhet, precision, selektivitet, matrisverkan osv. Valet av intern standard är viktigt för att korrigera för eventuell förlust av analyter under de olika stegen i provhanteringen och bioanalysen, vilket säkerställer analysens robusthet. Om möjligt bör en deuterium- eller 13C-stabil intern standard användas, annars kan en analog med liknande reaktivitet, återvinning och kromatografiska egenskaper ersättas. Det är också absolut nödvändigt att om möjligt beakta och utvärdera metaboliska vägar för den intressanta analyten; omvandling av metaboliter tillbaka till modermolekylen måste undvikas under derivatiseringsförfarandet, eftersom dessa processer ofta inbegriper svåra förhållanden (pH, värme, långa inkubationstider osv.). Tyvärr kan detta kompliceras av bristen på referensstandarder för metaboliterna och bristen på metabolisk information tidigt i livscykeln för läkemedelsutveckling på grund av differentierade eller påskyndade utvecklingsstrategier.

Kemisk derivatisering som konstform

Användningen av kemisk derivatisering har minskat under de senaste åren i takt med att nya separationstekniker har utvecklats och blivit mer vanliga. Utvecklingen av superkritisk vätskekromatografi (SFC), till exempel, har öppnat en ny väg för chiral stereoisomerisk analys, vilket minskar behovet av chiral derivatisering i vissa fall . Känsligare generationer av trippelkvadrupol-masspektrometriska instrument med ny eller förbättrad joniseringsteknik gör att detektionsgränserna sjunker till låga picogramnivåer, vilket leder till att efterfrågan på kemisk derivatisering för att förbättra känsligheten (genom förbättrad jonisering eller selektivitet) har minskat. Andra tekniker som UHPLC, mikro/nano-LC (för bättre joniseringseffektivitet) och TOF-instrument med möjlighet till jonrörlighet (elektronisk separation snarare än kemisk/fysisk) har också bidragit till den minskade användningen av kemisk derivatisering i bioanalytiska laboratorier. Med detta sagt används tekniken fortfarande för mycket komplexa separationer där ovannämnda tekniker inte kan ge tillräcklig effekt. Ibland har en koppling av kemisk derivatisering med någon av dessa tekniker en förbättrad/tilläggsverkan. I synnerhet har kombinationen av SFC med chiral derivatisering visat sig vara överlägsen för chiral separation jämfört med SFC-analysen (data visas inte).

På grund av denna nedgång för tekniken och dess komplexitet jämfört med andra analytiska tekniker har kemisk derivatisering utvecklats till en speciell ”konstform” i laboratoriet, som kräver specialkunskaper kombinerat med en stark kemikompetens. Som en följd av detta lyckas färre forskare i DMPK-miljöer behärska tekniken och bli duktiga på att tillämpa den. Frågan blir då hur man kan bevara dessa färdigheter och föra dem vidare till framtida generationer av analytiska forskare. Specialnummer som detta, översiktsartiklar, bokkapitel, vägledning som innehåller experimentella protokoll kommer förhoppningsvis att underlätta och främja användningen av kemisk derivatisering som ett stort analytiskt verktyg.

Outline

Detta temanummer omfattar framsteg inom befintliga derivatiseringstekniker som används inom bioanalytisk forskning, samt innovativa nya metoder och tillvägagångssätt (t.ex, kombination av derivatisering med mikroflödes-LC-MS och idén om nya tekniker för kemisk märkning av Niwa et al. ).

Utgåvan syftar till att täcka aspekter som rör:

• Derivatiseringsmetoder i LC-MS bioanalys (inklusive HPLC);

• Peptidderivatisering för analys av proteinterapeutiska läkemedel;

• Kirala derivatiseringsreagenser tillämpade på biologiska prover (se Vashistha et al. );

• Derivatisering för analys av endogena föreningar (se ”Beyond Classical Derivatization: Analyte ’derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds” av Barnaby et al. , eller ”Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses” av Marcos et al. );

• Derivatization procedures in human doping control (se den intressanta översikten av Athanasiadou et al. ).

Som det är sant att kemisk derivatisering bara är ytterligare ett verktyg i den bioanalytiska verktygslådan är det ett ”måste” för ett DMPK-laboratorium och ett verktyg som kommer att fortsätta att ha en inverkan på många bioanalytiska utmaningar.

Därför, om du inte gillar din analyt, ändra den (med kemisk derivatisering alltså)!

.