Kalciumalginat och kalciumalginat-chitosanpärlor som innehåller celecoxib som lösliggörs i en självemulgerande fas
Abstract
I detta arbete utvecklades alginat- och alginat-chitosanpärlor som innehåller celecoxib som lösliggörs i en självemulgerande fas i syfte att erhålla ett system för läkemedelstillförsel för oral administrering, som kan fördröja läkemedelsfrigörelsen i sur miljö och främja den i tarmutrymmet. Rationalen för detta arbete var kopplad till önskan att förbättra celecoxibs terapeutiska effektivitet genom att minska dess biverkningar i magsäcken och gynna dess användning i profylax av tjocktarmscancer och som adjuvant i terapin av familjär polypos. Systemen framställdes genom jonotropisk gelering med hjälp av nålar med olika diametrar (400 och 600 μm). Morfologi, partikelstorlek, svällningsbeteende och in vitro-läkemedelsfrisättning hos pärlorna i vatten med olika pH undersöktes. De experimentella resultaten visade att närvaron av kitosan i formuleringen orsakade en ökning av pärlstrukturens mekaniska motståndskraft och, som en följd av detta, en begränsning av pärlornas svällningsförmåga och en minskning av läkemedelsfrisättningen vid neutralt pH. Alginat-chitosanpärlor skulle kunna vara ett bra verktyg för att garantera en leverans av celecoxib i kolonin.
1. Introduktion
Läkemedelsleveranssystem som innehåller biologiskt nedbrytbara naturliga polymerer är föremål för allt fler forskningsstudier med tanke på de fördelar som dessa material kan erbjuda . Bland dem har de som innehåller alginat och kitosan utnyttjats i stor utsträckning inom läkemedelsområdet.
Alginat är en vattenlöslig naturlig biopolymer som utvinns från brunalger och består av alternerande block av 1-4 α-L-guluronsyra- och β-D-mannuronsyrarester . Denna polymer bildar hydrogeler i närvaro av tvåvärda katjoner som Ca2+, Ba2+, Sr2+ och Zn2+ och denna egenskap gör det möjligt att framställa läkemedelsfyllda pärlor . Mekanismen för denna geleringsprocess inbegriper guluronrester med specifik kelering av Ca2+ som bildar den så kallade ”egg-box”-strukturen. Många forskare har fokuserat sin uppmärksamhet på utvecklingen av kalciumalginatpärlor som kontrollerade system för läkemedelstillförsel för oral administrering av läkemedelsmolekyler och proteiner .
Chitosan är en biokompatibel, biologiskt nedbrytbar, icke-toxisk, linjär polysackarid som består av D-glukosamin- och N-acetyl-D-glukosamin-enheter som är sammanlänkade med β-(1-4)-glykosidiska bindningar . Chitosan kan framställas genom partiell deacetylering av chitin från skal från kräftdjur och används i stor utsträckning för cellodling, läkemedelstillförsel och livsmedelstillsatser .
Korslänkning av alginat och kitosan i en hydrogel används för att tillhandahålla material som är användbara för medicinska och farmaceutiska tillämpningar; de erhållna systemen kännetecknas av en förbättrad stabilitet jämfört med de system som erhålls med en enskild polymer . Vid kontrollerad läkemedelstillförsel har alginat-chitosan-polyelektrolytkomplex fått mycket uppmärksamhet under de senaste åren. De två polymererna bildar polyelektrolytkomplexet via den joniska interaktionen mellan karboxylresterna i alginat och aminoresterna i kitosan. Alginat-kitosanpärlor kan framställas med hjälp av olika metoder: tvåstegsmetoden och enstegsmetoden . I den första metoden framställs gelpärlor av kalciumalginat genom att en lösning av alginat släpps ner i ett geleringsbad som innehåller kalciumjoner. De resulterande pärlorna överförs sedan till en kitosanlösning för att bilda ett membran på deras yta. För detta enstegsförfarande krävs att dropparna av alginatlösning faller ner i en vattenlösning som innehåller både alginatets geleringsmedel (t.ex. kalciumjoner) och kitosan . Valet av tillverkningsmetod är avgörande för pärlornas egenskaper på grund av mängden bundet kitosan i den resulterande produkten. Samtidigt påverkas pärlornas egenskaper av molekylvikten hos de valda polymererna och/eller av procentandelen av de olika resterna i polymermolekylerna .
Celecoxib, ett fluorerat bensensulfonamidderivat, är ett icke-steroidalt antiinflammatoriskt läkemedel (NSAID) med en mycket selektiv cyklooxygenas-2 (COX-2)-hämmande verkan. Det har antiinflammatorisk, analgetisk och antipyretisk verkan på grund av inhiberingen av prostaglandinsyntesen som katalyseras av COX-2. På senare tid har detta läkemedel ofta undersökts med avseende på dess anticanceraktivitet med hjälp av in vitro- och in vivo-modeller . Prekliniska studier av celecoxib rapporterade en framträdande anticanceraktivitet mot skivepitelcancer i huvud och hals, tjocktarmscancer, bröstcancer och lungcancer .
I detta arbete utvecklades alginat- och alginat-chitosanpärlor som innehåller celecoxib som lösliggjorts i en självemulgerande fas, i syfte att erhålla ett system för läkemedelstillförsel för oral administrering som kan fördröja läkemedelsfrigörelsen i sur miljö och främja den i tarmutrymmet. Rationalen för detta arbete var kopplad till önskan att förbättra celecoxibs terapeutiska effektivitet genom att minska dess biverkningar i magsäcken och gynna dess användning i profylax av tjocktarmscancer och som adjuvant i terapin av familjär polypos . Syftet med den aktuella studien var att utvärdera och jämföra egenskaperna hos celecoxib-belastade kalciumalginat- och kalciumalginat-chitosanpärlor. Morfologi, partikelstorlek, svällningsbeteende och in vitro-läkemedelsfrisättning av pärlor i vatten med olika pH undersöktes.
2. Material och metoder
2.1. Material
Celecoxib erhölls från Chemos GmbH (Regenstauf, Tyskland). Vattenfri kalciumklorid och natriumalginat (molekylvikt 120000-190000 g/mol; förhållandet mellan mannuron- och guluronrester är 1,56) köptes från Sigma Aldrich (Milano, Italien), medan chitosan med låg molekylvikt kom från Fluka (Milano, Italien). Labrasol (caprylocaproyl macrogol-8 glycerider) var en gåva från Gattefossè (Milano, Italien); TPGS (D-α-tokoferylpolyetylenglykol 1000-succinat) var en vänlig gåva från Isochem (Gennevillers, Frankrike). Alla andra kemikalier var av analytisk kvalitet.
2.2. Framställning av kalciumalginatpärlor
Kalciumalginatpärlor framställdes genom geleringsmetod med kalciumjoner som tvärbindningsmedel. I detalj blandades en vattenlösning av 1,5 % (w/w) natriumalginat med en läkemedelsladdad självemulgerande fas i förhållandet 4:1 och tillsattes droppe för droppe till en 100 mM CaCl2-lösning . Den självemulgerande fasen framställdes genom att blanda vägda mängder Labrasol och TPGS vid 50 °C och lösa celecoxib i hjälpmedelslösningen. Emulsionen (natriumalginatlösning och självemulgerande fas) extruderades manuellt i härdningsbadet genom nålar med en innerdiameter på 400 eller 600 μm, under konstant försiktig omrörning, vid rumstemperatur. Efter 15 minuter samlades pärlorna upp, tvättades med avjoniserat vatten för att eliminera överskottet av kalciumjoner och torkades sedan vid 40 °C över natten. Sammansättningen av de framställda formuleringarna, med beteckningarna CAl 600 och CAl 400, anges i tabell 1.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Framställning av kalciumalginat-kitosanpärlor
Kalciumalginat-kitosanpärlor (identifierade som CAlCh 600 och CAlCh 400) framställdes enligt en enstegsmetod. Förfarandet var identiskt med det som användes för alginatpärlor med undantag för att härdningsbadet var en 0,2 % (w/w) kitosanlösning i utspädd ättiksyra (1 %) som innehöll CaCl2 i en koncentration av 100 mM. Chitosanformuleringarnas sammansättning redovisas i tabell 1.
2.4. Morfologisk analys och analys av partikelstorlek
Morfologin hos de våta och torkade pärlorna och partikelstorleken hos de torkade pärlorna analyserades med hjälp av ett Motic SMZ168 stereomikroskop och en programvara för bildanalys (Motic Image Plus 2.0). För varje formulering beräknades partikelstorleken som medelvärdet av storleken på 20 torkade partiklar.
2,5. Läkemedelsinnehåll
Sex milligram av läkemedelsladdade torkade pärlor löstes i fosfatbuffertlösning (100 mL) vid pH 6,8 tillsatt av 0,75 % (w/v) natriumlaurylsulfat vid 70 °C under omrörning i två timmar. Efter avkylning filtrerades de erhållna lösningarna och analyserades spektrofotometriskt vid 255 nm; resultaten är medelvärdet av minst tre bestämningar.
2.6. Svällningsstudier
Svällningsstudier utfördes vid 37 °C på torkade pärlor som sattes i tre vattenmedier som kännetecknas av olika pH: saltsyra vid pH 1,0 och fosfatbuffert vid pH 6,8 och pH 7,4.
Närligt vägda mängder torkade pärlor av kalciumalginat och kalciumalginat-chitosan sattes i glasflaskor som innehöll 5 mL av varje vätska. Efter fasta tidsintervall (5, 15, 30, 60 och 120 minuter) togs proverna upp, torkades försiktigt med papper och vägdes på nytt. Den dynamiska viktförändringen av pärlorna med avseende på tid, definierad som svällningsgrad (Sw), beräknades enligt följande ekvation: där är vikten av pärlorna i svällt tillstånd vid tidpunkten och är de torkade pärlornas ursprungliga vikt .
2.7. Celecoxib Release Study
In vitro-frisättningsstudierna utfördes i saltsyra vid pH 1,0 och i fosfatbuffert vid pH 6,8 och vid pH 7,4 tillsattes 0,75 % natriumlaurylsulfat för att garantera upprätthållandet av sänkeförhållandena. Studierna utfördes genom att exakt vägda mängder av varje formulering, motsvarande 8 mg celecoxib, placerades i 500 ml av den valda vätskan vid 37 °C med en rotationshastighet på 100 rpm (apparat 2, paddel). Filtrerade prover togs ut med bestämda tidsintervall utan byte och analyserades med avseende på celecoxibinnehållet med hjälp av en UV-spektrofotometer vid 255 nm när vätskan var HCl och fosfatbuffert vid pH 6,8 eller vid 256 nm när det gällde fosfatbuffert vid pH 7,4. Varje experiment utfördes i tre exemplar.
Läkemedelsfrisättningsprestanda för kalciumalginat och kalciumalginat-chitosanpärlor jämfördes med hjälp av upplösningsparametrarna t10%, t50% och t90% som anger de tidpunkter då 10%, 50% och 90% av läkemedlet frigjordes och f2-likhetsparametern . För att kurvorna ska betraktas som likartade bör f2-värdena ligga nära 100, och f2-värden som är större än 50 (50-100) garanterar att de två kurvorna är likartade eller likvärdiga.
2.8. Statistisk analys
Resultaten analyserades statistiskt för att testa signifikanta skillnader genom Students t-test, med 95 % konfidensintervall; värden mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.
3. Resultat och diskussion
Alginat- och alginat-chitosanpärlor erhölls genom jonotropisk geleringsmetod genom att droppa en emulsion, bestående av en vattenlösning av alginat och den självemulgerande fasen med läkemedelsbelastning, genom 23 G (600 μm) eller 27 G (400 μm) nålar, i ett kalciumklorid- eller i ett kalciumklorid-chitosan geleringsbad. De hjälpämnen som valdes för den självemulgerande fasen var Labrasol, en flytande komponent med självemulgerande och löslighetsförbättrande egenskaper, och D-α-tokoferylpolyetylenglykol 1000-succinat som koemulgerande och absorptionsförbättrande medel (tabell 1). Sammansättningen av den självemulgerande fasen var densamma som användes i ett tidigare arbete.
Stereomikroskopiska bilder av våta och torra alginat- och alginat-chitosankulor redovisas i figurerna 1 och 2. Omedelbart efter beredningen visar CAl 600-pärlor (figur 1(a)) regelbunden form och homogena dimensioner; de är vita och ogenomskinliga med en slät, glänsande och homogen yta.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Torkningsprocessen ändrar inte pärlornas form men leder till att deras dimensioner minskar och ändrar egenskaperna hos deras yta, som är oregelbunden och skrynklig (figur 1 b). Vattenförlusten leder till att avståndet mellan de polymera kedjorna minskar och att pärlornas struktur förändras, vilket innebär att de inte är kompakta och kontinuerliga utan består av små mikrokärnor som fäster vid varandra. De helt svullna CAlCh 600-partiklarna är svagt gula och ganska regelbundna till formen och har en slät yta (figur 1 c)). I detta fall påverkar torkningsprocessen pärlornas sfäriska form (figur 1(d)); de blir ellipsoida, deras dimensioner minskar och deras yta är mycket grov. Efter torkning observeras dessutom en partiell agglomerering av pärlorna på ytan, vilket beror på chitosans vidhäftande egenskaper. När det gäller pärlor som framställts med en nål på 400 μm (figurerna 2(a)-2(c)) visar bilderna som tagits upp omedelbart efter framställningen att partiklarna i båda formuleringarna (med eller utan kitosan) inte är homogena i diametern även om de har en regelbunden form. CAl 400 och CAlCh 400 torra pärlor (figur 2(b)) har en yta som kännetecknas av asperitet och konkavitet; dessutom är partikelformen i fallet med alginat-chitosanformuleringen helt oregelbunden och närvaron av fasta broar av kitosan är väl synlig, vilka binder pärlorna och förhindrar att de separeras.
Genomsnittsstorleken på de celecoxib-belagda pärlorna ligger på mellan 715 och 896 μm (tabell 2). Pärlornas diameter påverkades avsevärt av diametern på den nål som användes vid framställningen (). Tillsatsen av kitosan till alginatpärlor ändrar signifikant deras dimensioner endast när 400 μm-nålen användes (). Som framgår av de höga värdena för standardavvikelsen är slutprodukten vid användning av 400 μm-nålen dessutom en familj av partiklar med inhomogena dimensioner.
|
||||||||||||||||||||||||
Alla formuleringar innehåller en hög mängd läkemedel (tabell 2) homogent fördelat i hjälpämnesmatrisen och skillnaderna mellan deras läkemedelsinnehåll var inte signifikanta utom för CAlCh 400 som var något lägre än de andra (). Procentandelen celecoxib i pärlorna överstiger det teoretiska värdet och detta beror på förlusten av Labrasol under härdningstiden , vilket är motiverat med tanke på den höga affiniteten mellan detta hjälpämne och vatten som driver ut det från pärlorna till geleringsbadet.
En speciell egenskap hos mikropartikulära system av alginat eller alginat-chitosan i torr form är deras förmåga att efter kontakt med en vattenhaltig vätska rehydrera, ta upp vätskan och genomgå en svällningsprocess, huvudsakligen förknippad med hydrering av polymerernas hydrofila grupper. När vätskan är vatten tränger det in i partiklarna och fyller porerna bland de polymera kedjorna och orsakar en betydande svällning av systemet, utan erosion eller sönderdelning. Om man väljer vätskor med olika pH kan pärlornas svällningsbeteende förändras. Därför har svällningsförmågan hos kalciumalginat och kalciumalginat-chitosanpärlor utvärderats i HCl vid pH 1,0 och i fosfatbuffertlösningar vid pH 6,8 och 7,4 (figur 3-5).
I sur miljö (figur 3) finns det inga skillnader i de fyra formuleringarnas svällningsförmåga; vid detta pH är den maximala svällningsgraden inte över 60 %. Alginat- och alginat-chitosankulorna absorberar en del av vätskan; deras vikt ökar till en början och förblir sedan konstant. Vid detta pH, för alginatsystemen (CAl 600 och CAl 400), protoneras polymerens karboxylatgrupper som är lokaliserade på partiklarnas yta och det bildas ett lager av alginsyra. Alginsyrans olöslighet i denna vätska och bildandet av vätebindningar, som bidrar till att öka strukturens stabilitet, hindrar ytterligare vätska från att tränga in i partiklarnas djupare lager, vilket begränsar deras svällning. Samma svällningsbeteende observeras för CAlCh 600- och CAlCh 400-systemen. Även om chitosan i sur miljö är lättlösligt och laddat för omvandling av sina aminenheter till NH3+-löslig form, är interaktionen mellan aminogrupper och protonerade karboxylgrupper inte tillräckligt stark för att främja svällning. Det begränsade totala svällningsbeteendet domineras således av kalciumalginatstrukturen.
Figurerna 4 och 5 visar att formuleringarna uppvisar hög svällningsförmåga vid pH 6,8 och pH 7,4. För CAl 600-formuleringen ökar partikelvikten snabbt, når en topp efter 30 minuter och minskar sedan abrupt på grund av erosion/desintegration av systemet. Detta beteende kan bero på en jonbytesreaktion mellan Na+ (som finns i fosfatbufferten) och Ca2+ kopplat till alginatets karboxylgrupper. Monovalenta joner ersätter bivalenta joner, vilket leder till att ”ägglådestrukturen” bryts upp och att avståndet mellan de polymera kedjorna ökar, vilket gynnar vätskeabsorptionen och svällningen av systemen. Denna process fortsätter tills det osmotiska trycket i pärlorna balanserar styrkan hos de tvärbindande bindningarna och de fysiska sammanflätningarna, som bevarar pärlornas struktur. Partiklarna börjar således sönderfalla och deras vikt minskar.
Resultaten från svällningsstudien visar att CAlCh 600 och CAlCh 400 pärlor kännetecknas av en mer motståndskraftig struktur jämfört med CAl 600 och CAl 400, vilket troligen kan tillskrivas interaktionerna mellan alginat- och kitosan-kedjorna. Den maximala svällningsgraden för kitosanpärlor är lägre än för alginat. Alginat-kitosan-systemen kan nå en svällningsjämvikt på cirka 30 minuter och bibehålla sin vikt på en konstant nivå fram till slutet av testet. Sannolikt är det interaktionerna mellan de två polymererna som ligger bakom bildandet av partiklar med ett betydande mekaniskt motstånd, vilket begränsar vätskeupptaget och strukturens sönderfall. Om man slutligen jämför svällningsbeteendet hos CAl 400 jämfört med CAl 600 och CAlCh 400 jämfört med CAlCh 600-pärlor (samma sammansättning, olika diameter på den nål som användes i beredningsprocessen) kan man notera att i fosfatbuffertar uppnådde CAl 400 och CAlCh 400 en maximal svällningstopp som var högre än CAl 600 respektive CAlCh 600.
De profiler för frisättning av läkemedel som erhållits från de olika formuleringarna vid pH-värdena 1,0, 6,8 och 7,4 visas i figurerna 6-8. Celecoxibfrisättningen in vitro påverkas av pH i den valda vätskan: den procentuella andelen läkemedel som frisätts i surt medium på två timmar är ganska låg och varierar mellan 12,70 % och 24,53 % (figur 6). Den fördröjda frisättningen av celecoxib kan tillskrivas systemens minskade svällningsförmåga i denna vätska; varken pärlornas sammansättning eller deras diameter påverkar frisättningen av läkemedlet (f2-parametervärdena är alltid över 50). Vid pH 1,0 styrs frisättningsprocessen endast av diffusion av läkemedlet. Detta resultat gör det möjligt att uppfylla det första syftet med detta forskningsarbete som är att minimera läkemedelsavgivningen i sur miljö för att främja och gynna denna process på tarmnivå.
I fosfatbuffert vid pH 6,8 kännetecknas formuleringarna av ett frisättningsbeteende som påverkas av sammansättningen och inte nämnvärt av dimensionerna (figur 7). I denna vätska sväller systemen inledningsvis och eroderar/desintegrerar sedan och följaktligen drivs läkemedelsfrisättningsprocessen först av diffusion och sedan av den polymera relaxationen. Alginatpärlor (CAl 600 och CAl 400) kan slutföra frisättningen av celecoxib på cirka åtta timmar, medan högst 75 % av läkemedlet i alginat-chitosanpärlor passerar i lösningen efter samma tid. Jämförelsen av resultaten från alginat- och alginat-chitosan-mikropartikelformuleringar visar att profilerna inte är likartade och att f2-värdena är lägre än 50. En möjlig förklaring till ett sådant beteende är den elektrostatiska interaktionen mellan alginatens karboxylgrupper och chitosans aminogrupper som förbättrar det polymera nätverkets mekaniska motståndskraft och minskar dess svullnad och erosion vid pH 6,8.
Förvånande nog saktar frisättningshastigheten för celecoxib främst in för CAlCh 400-formuleringen, även om den formuleringen kännetecknas av den minsta partikelstorleken. Förmodligen leder den lilla diametern och den stora ytan hos dessa partiklar till att det bildas ett tjockare kitosanskikt runt pärlorna, vilket utgör ett stort motstånd mot vätskeupptaget och därmed mot läkemedelsfrisättningen.
Också vid pH 7,4 kan skillnaderna i läkemedelsfrisättningen tillskrivas sammansättningen av formuleringen snarare än partikeldimensionerna (figur 8). Alla formuleringar uppvisade en nästan konstant frisättningshastighet för läkemedlet. Det finns inga skillnader mellan CAl 600 och CAl 400 och mellan CAlCh 600 och CAlCh 400 frisättningskurvor; när kitosan finns i pärlorna minskar läkemedelsfrisättningshastigheten.
Samma slutsatser framgår av analysen av resultaten av läkemedelsfrisättningen genom upplösningsparametrarna (t10 %, t50 % och t90 %) (tabell 3). Skillnaderna i pärlornas frisättningsbeteende upptäcks även genom upplösningsparametrarna t10%, t50% och t90% och är väl synliga för den tid som krävs för att frisätta 50 och 90% av det laddade läkemedlet. I fosfatbuffertlösningar kräver alginat-chitosanpärlor längre tid för att avge 50 och 90 % av celecoxib jämfört med alginatpärlor. Närvaron av alginat-chitosankomplexet orsakar troligen en ökning av strukturella rynkor, oregelbundenhet och komplexitet i pärlstrukturen, vilket gör det svårt att frigöra läkemedlet.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Slutsatser
De undersökta celecoxib-belagda alginat- och alginat-chitosanpärlorna minimerar läkemedelsfrisättningen i sur miljö som gynnar denna process vid tarmens pH (6,8 och 7,4). De experimentella resultaten visar att närvaron av chitosan i formuleringen är ansvarig för en ökning av pärlstrukturens motståndskraft och, som en följd av detta, för en begränsning av pärlans svällningsförmåga och för en minskning av läkemedelsfrisättningshastigheten vid neutralt pH. Alginat-chitosanpärlor skulle kunna vara ett värdefullt vehikel för celecoxib för doseringsformer som är användbara som adjuvant terapi hos patienter med familjär polypos och precancerösa sjukdomar i tjocktarmen.
Kompletterande intressen
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Leave a Reply