Holliday junction

De två vägarna för homolog rekombination i eukaryoter, som visar bildandet och upplösningen av Holliday junctions

Holliday junction är en viktig intermediär i homolog rekombination, en biologisk process som ökar den genetiska mångfalden genom att gener flyttas mellan två kromosomer, liksom i platsspecifika rekombinationshändelser med integraser. De är dessutom inblandade i reparation av dubbelsträngsbrott. Dessutom kan korsformiga strukturer med Holliday junctions uppstå för att avlasta spiralformade spänningar i symmetriska sekvenser i DNA:s superspiraler. Även om fyrarmiga korsningar också förekommer i funktionella RNA-molekyler, t.ex. U1-spliceosomalt RNA och hårnålsribozymet från tobaksringfläcksviruset, innehåller dessa vanligen oparade nukleotider mellan de parade dubbelhelikala domänerna och antar därför inte strikt Holliday-strukturen.

Holliday-korsningarna vid homolog rekombination sker mellan identiska eller nästan identiska sekvenser, vilket leder till ett symmetriskt arrangemang av sekvenser kring den centrala korsningen. Detta gör att en grenmigrationsprocess kan ske där strängarna rör sig genom korsningspunkten. Klyvning, eller upplösning, av Holliday-kopplingen kan ske på två sätt. Klyvning av den ursprungliga uppsättningen strängar leder till två molekyler som kan uppvisa genkonvertering men inte kromosomalt crossover, medan klyvning av den andra uppsättningen av två strängar leder till att de resulterande rekombinanta molekylerna uppvisar crossover. Alla produkter, oavsett klyvning, är heteroduplexer i området för Holliday junction migration.

Många proteiner kan känna igen eller förvränga Holliday junction-strukturen. En sådan klass innehåller korsningslösande enzymer som klyver korsningarna, ibland på ett sekvensspecifikt sätt. Sådana proteiner förvränger korsningens struktur på olika sätt och drar ofta korsningen till en ostaplad konformation, bryter de centrala basparen och/eller ändrar vinklarna mellan de fyra armarna. Andra klasser är grenmigrationsproteiner som ökar utbyteshastigheten med storleksordningar och platsspecifika rekombinaser. Hos prokaryoter faller Holliday junction resolvaser in i två familjer, integraser och nukleaser, som var och en är strukturellt likartade även om deras sekvenser inte är konserverade.

I eukaryoter är två primära modeller för hur homolog rekombination reparerar dubbelsträngsbrott i DNA två primära modeller för hur homolog rekombination reparerar dubbelsträngsbrott i DNA, nämligen den dubbelsträngsbrottsreparerande vägen (DSBR) (ibland kallad modellen med dubbla Holliday junction) och den syntetiseringsberoende strängannealningsvägen (SDSA). Vid dubbelsträngsbrott bryts 3′-ändan ner och den längre 5′-ändan invaderar den angränsande systerkromatiden och bildar en replikationsbubbla. När denna bubbla närmar sig det trasiga DNA:t invaderar den längre 5′-antisense-strängen återigen sense-strängen i denna del av DNA:t och transkriberar en andra kopia. När replikationen slutar kopplas de båda svansarna samman igen för att bilda två Holliday Junctions, som sedan klyvs i olika mönster av proteiner. En animation av denna process kan ses här.

Dubbelsträngade DNA-brott i bakterier repareras genom RecBCD-vägen för homolog rekombination. Brytningar som sker på endast en av de två DNA-strängarna, så kallade single-strand gaps, tros repareras av RecF-vägen. Både RecBCD- och RecF-vägarna omfattar en serie reaktioner som kallas grenvandring, där enskilda DNA-strängar byts ut mellan två korsade molekyler av duplex-DNA, och upplösning, där dessa två korsade DNA-molekyler skärs isär och återställs till sitt normala dubbelsträngade tillstånd. Homolog rekombination förekommer i flera grupper av virus. I DNA-virus, t.ex. herpesvirus, sker rekombinationen genom en ”break-and-rejoin”-mekanism som i bakterier och eukaryoter. I bakterier underlättas grenvandringen av RuvABC-komplexet eller RecG-proteinet, molekylära motorer som använder energin från ATP-hydrolys för att flytta korsningen. Förbindelsen måste sedan lösas upp i två separata duplexer, vilket återställer antingen föräldrakonfigurationen eller en korsad konfiguration. Upplösningen kan ske antingen horisontellt eller vertikalt under homolog rekombination, vilket ger patchprodukter (om de har samma orientering under reparation av dubbelsträngsbrott) eller skarvprodukter (om de har olika orientering under reparation av dubbelsträngsbrott). RuvA och RuvB är grenmigrationsproteiner, medan RuvC är ett korsningslösande enzym.

Det finns belägg för rekombination i vissa RNA-virus, särskilt positivt sinnande ssRNA-virus som retrovirus, picornavirus och coronavirus. Det finns en kontrovers om huruvida homolog rekombination förekommer i negativ-sense ssRNA-virus som influensa.

ResolutionEdit

I den knoppande jästen Saccharomyces cerevisiae kan Holliday-junkterna lösas upp av fyra olika vägar som står för i stort sett all upplösning av Holliday-junkterna in vivo. Den väg som ger upphov till majoriteten av korsningarna i S. cerevisiae budding yeast, och möjligen i däggdjur, involverar proteinerna EXO1, MLH1-MLH3 heterodimer (kallad MutL gamma) och SGS1 (ortolog av Bloom-syndromets helicas). MLH1-MLH3-heterodimern binder företrädesvis till Holliday junctions. Det är ett endonukleas som gör enkelsträngsbrott i superspolat dubbelsträngat DNA. MLH1-MLH3-heterodimern främjar bildandet av crossover-rekombinanter. Medan de andra tre vägarna, som involverar proteinerna MUS81-MMS4, SLX1 respektive YEN1, kan främja upplösningen av Holliday junctions in vivo, har frånvaro av alla tre nukleaser endast en blygsam inverkan på bildandet av crossover-produkter.

Dubbelmutanter som är borttagna för både MLH3 (huvudväg) och MMS4 (mindre väg) uppvisade dramatiskt minskad crossing over jämfört med vildtypen (6- till 17-faldigt); sporernas livsduglighet var dock rimligt hög (62 %) och den kromosomala disjunktionen verkade mestadels funktionell.

Men även om MUS81 är en komponent i en mindre korsningsväg i meiosen hos knoppande jäst, växter och ryggradsdjur, verkar MUS81 i protozoen Tetrahymena thermophila vara en del av en väsentlig, om inte den dominerande korsningsvägen. MUS81-vägen verkar också vara den dominerande crossover-vägen i fissionsjästen Schizosaccharomyces pombe.

Mash4- och MSH5-proteinerna bildar en hetero-oligomerisk struktur (heterodimer) i jäst och människor. I jästen Saccharomyces cerevisiae verkar MSH4 och MSH5 specifikt för att underlätta crossovers mellan homologa kromosomer under meiosen. MSH4/MSH5-komplexet binder och stabiliserar dubbla Holliday-junktioner och främjar deras upplösning till korsningsprodukter. En hypomorf MSH4-mutant (delvis funktionell) av S. cerevisiae uppvisade en 30-procentig minskning av antalet korsningar i hela genomet och ett stort antal meioser med kromosomer som inte byts ut. Trots detta gav denna mutant upphov till mönster för spors livsduglighet som tyder på att segregering av kromosomer som inte byts ut skedde på ett effektivt sätt. I S. cerevisiae är en korrekt segregering uppenbarligen inte helt beroende av korsningar mellan homologa par.