Articles / september 24, 2021

Hemofagocytisk lymfohistiocytos kan diagnostiseras korrekt med hjälp av histomorfologiska kriterier för benmärg

Hemofagocytisk lymfohistiocytos (HLH) är en sällsynt inflammatorisk multisystemssjukdom med diagnostiska kriterier som bygger på HLH-2004-undersökningen. Hemofagocytos är det enda histomorfologiska kriteriet, men är isolerat varken specifikt eller känsligt för diagnosen HLH. Objektiva tröskelvärden för kliniska kriterier och laboratoriekriterier har fastställts, men specifika kriterier för histomorfologiska bevis på hemofagocytos vid HLH har inte utvärderats eller fastställts på ett rigoröst sätt. Vi försökte fastställa om numeriska och objektiva kriterier för morfologisk hemofagocytos kunde identifieras och om sådana kriterier skulle underlätta diagnosen av HLH. Vi analyserade de morfologiska dragen av hemofagocytos hos 78 patienter som presenterade kliniska drag som var misstänkta för HLH: 40 patienter med och 38 patienter utan HLH. Vi visar att enbart icke-nukleerad erytrofagocytos är ett ospecifikt fynd, medan hemofagocytos av granulocyter , nukleerade erytrocyter (4 per 1000 celler, AUC: 0,92, 95 %CI: 0,87, 0,98) och minst en hemofagocyt som innehåller flera nukleerade celler (AUC: 0,91, 95 %CI: 0,85, 0,95) är starkt associerade med HLH. Gemensam modellering av hemofagocyter som innehåller uppslukade granulocyter, nukleerade erytrocyter och lymfocyter skiljde effektivt mellan HLH och icke-HLH (korsvaliderad AUC: 0,90, 95 %CI: 0,83, 0,97).

Introduktion

Hemofagocyttisk lymfohistiocytos (HLH) är ett sällsynt livshotande syndrom som uppträder sekundärt till allvarlig systemisk immunaktivering.1 Proliferation av cytotoxiska T-celler leder till ökad cytokinproduktion och aktivering av vävnadsresistenta makrofager. I slutändan kan skador på flera slutorgan som orsakas av massiv inflammation leda till en dödlig utgång om inte diagnosen ställs i tid och lämplig behandling inleds.2

Hemofagocytisk lymfohistiocytos drabbar patienter i alla åldrar och uppträder som en ärftlig sjukdom, eller sekundärt i samband med predisponerande tillstånd som förändrar det normala immunsvaret. Den ärftliga formen av sjukdomen uppträder i tidig barndom och är förknippad med homozygota mutationer i gener som är involverade i CD8 T-cell- och NK-cellsmedierad immunitet.3 Dessa genetiska former av HLH är enhetligt dödliga utan hematopoietisk celltransplantation eller genterapi. Sekundär HLH kan förekomma sporadiskt hos friska individer, men påträffas oftare hos patienter med hematologisk malignitet, autoimmun sjukdom och iatrogen immunosuppression. Praktiskt taget alla fall anses kräva en infektiös eller icke-infektiös utlösare för att initiera det avvikande immunsvaret, oavsett den underliggande immundysfunktionen.74

Hemofagocytisk lymfohistiocytos uppträder plötsligt under en period av flera dagar till veckor med ett konsekvent mönster av feber, pancytopeni och splenomegali. Vanliga laboratorieavvikelser är hyperferritinemi, hypofibrinogenemi, hypertriglyceridemi, förhöjd löslig IL-2-receptor och onormala leverfunktionstester.1 De mest använda diagnostiska kriterierna för HLH utvecklades för att inkluderas i HLH-2004-studien som kräver genetiska bevis för en mutation som är associerad med HLH eller uppfyllande av 5 av 8 kliniska kriterier inklusive feber, splenomegali, bikytopeni, hypertriglyceridemi eller hypofibrinogenemi, bevis på hemofagocytos i benmärg eller andra vävnader, låg eller frånvarande NK-cellsaktivitet, förhöjt ferritin och förhöjd löslig IL-2-receptor.3 Även om de inte är validerade för vuxna är dessa HLH-2004-kriterier brett tillämpade på patienter i alla åldrar.

Patologer spelar en viktig roll i det diagnostiska arbetet med patienter som misstänks ha HLH. Benmärgsundersökning utförs för att utvärdera om hemofagocytos föreligger, identifiera underliggande malignitet och utesluta benigna eller neoplastiska imitationer. Förekomst av hemofagocytos i benmärgen uppfyller ett av HLH-2004:s diagnostiska kriterier, men inga accepterade diagnostiska tröskelvärden eller riktlinjer för rapportering har fastställts. Avsaknaden av evidensbaserade riktlinjer leder till stor osäkerhet bland patologer om vilken grad av hemofagocytos som är tillräcklig för att uppfylla detta kriterium. Ytterligare en utmaning är att hemofagocytos inte är specifik för diagnosen HLH i avsaknad av andra kliniska kännetecken för sjukdomen. Sällsynt erytrofagocytos ses ofta i benmärgsaspirat och ökad hemofagocytos kan påträffas vid sepsis, blodtransfusioner, hematopoetisk transplantation, kemoterapi och myelodysplastiskt syndrom118 .

Med tanke på avsaknaden av ett definierat tröskelvärde för att uppfylla kriteriet för diagnosen HLH utformade vi denna retrospektiva studie för att förhöra oss om kvantitativa eller kvalitativa morfologiska kännetecken för hemofagocytos i benmärgsaspirat är prediktiva för en eventuell diagnos av HLH. Vi identifierade en kohort av patienter som presenterade kliniska egenskaper som gav anledning till oro för HLH och deras aspirat undersöktes blint.

Hemofagocyter räknades per 1 000 nukleerade celler i enlighet med linjen för deras intagna hematopoetiska innehåll (figur 1). Förutom kvantitativa egenskaper utvärderade vi ett binärt morfologiskt kännetecken, närvaron av flera nukleerade celler inom en enda hemofagocyt, som en möjlig prediktiv egenskap för HLH.

Metoder

Patienturval

Vi sökte i databasen Pathology Laboratory Information Service (Powerpath) med följande sökord: Vi använde följande sökord: ”hemophagocytic lymphohistiocytosis”, ”hemophagocytosis”, ”erythrophagocytosis” och ”HLH”. Denna sökning gav 258 resultat mellan den 1 januari 2013 och den 7 januari 2017, och inkluderade text från vilken plats som helst i den diagnostiska rapporten, inklusive den tillhandahållna kliniska informationen, den mikroskopiska beskrivningen, den diagnostiska linjen och/eller den diagnostiska kommentaren (figur 2). Dessa patienters journaler granskades av EG för att bedöma om klinisk misstanke om HLH förelåg vid tidpunkten för benmärgsaspirationen, antingen angiven på provtagningsformuläret (dvs. ”uteslut HLH” eller ”oro för HLH”) eller förtecknad i differentialdiagnosen i den elektroniska patientjournalen (EMR) inom en vecka före biopsin. Demografisk information, kliniska egenskaper, diagnostiska intryck, patologiska egenskaper och laboratorievärden vid tidpunkten för biopsin samlades in för varje patient. Patienterna klassificerades som ”HLH” och ”icke-HLH” baserat på de konsulterande hematologernas diagnostiska intryck som beskrevs i de kliniska anteckningarna. Den slutliga diagnosen i alla fall fastställdes utifrån HLH-2004-kriterierna tillsammans med den övergripande kliniska bilden. Patienterna uteslöts från analysen om hemofagocytos noterades som en tillfällighet oberoende av klinisk oro för HLH, om bilderna inte fanns tillgängliga för granskning, om HLH övervägdes men diagnosen var tvetydig efter bearbetning, eller om en dokumenterad historia av HLH-riktad behandling noterades före biopsin. Denna studie godkändes av Stanford Universitys institutionella granskningsnämnd.

Utvärdering av benmärgsaspirat

Benmärgsaspirat (Wright-Giemsa-färgade) från HLH- och icke-HLH-patienter utvärderades blint. Varje aspiratglas undersöktes först med låg effekt (4x) för att identifiera områden med hemofagocytos och välja ett lämpligt glas för att räkna hemofagocyter. Tvåhundrafemtio intakta nukleerade celler räknades i varje kvadrant på ett enda aspirat per fall i områden med den högsta tätheten av hemofagocyter. Histiocyterna räknades efter linjen av intagna celler (mogna RBC, nRBCS, granulocyter och lymfocyter) och summan av hematopoetiska progenitorceller (HPC) beräknades som det totala antalet histiocyter som innehöll intagna hematopoetiska celler. Förekomsten av flera nukleerade celler i en enda hemofagocyt noterades också.

De metoder som användes för den statistiska analysen beskrivs i Online Supplementary Appendix.

Resultat

Patienternas egenskaper

Patienternas egenskaper hos de 40 patienterna med HLH och 38 patienterna utan HLH sammanfattas i tabell 1. Det fanns inga signifikanta skillnader i fråga om ålder eller kön. HLH-patienter var mer benägna att presentera en underliggande malignitet jämfört med gruppen utan HLH (56 % jämfört med 24 %; P<0,05), med diffust storcelligt B-celligt lymfom (DLBCL) som den vanligaste primärdiagnosen bland patienter med HLH (tabellerna 1 och 2). Epstein-Barr-virus (EBV) var den vanligaste infektionsutlösaren som identifierades hos patienter med HLH. 32,5 % av patienterna i HLH-gruppen hade bevis på EBV-infektion genom PCR-detektion i perifert blod eller immunohistokemi jämfört med 10 %.5 % i icke-HLH-gruppen (P<0,01).

Som väntat var det vanligare att patienter som diagnostiserats med HLH uppvisade kliniska fynd och laboratoriefynd som uppfyllde vart och ett av diagnoskriterierna för HLH-2004 (tabell 1). Signifikanta skillnader observerades mellan HLH- och icke-HLH-grupperna i genomsnittsvärdet för varje laboratorietest (triglycerider, fibrinogen, ferritin och lösligt IL-2r) och antalet patienter som uppfyllde varje enskilt HLH-2004-kriterium, med undantag för natural killer (NK)-cellfunktion. Även om försämrad eller utebliven NK-cellsfunktionstestning anses vara ett giltigt screeningverktyg för patienter med genetiska defekter i cytotoxicitet, beställs detta test sällan hos vuxna med sekundär HLH och har en hög misslyckandefrekvens, vilket begränsar dess diagnostiska användbarhet.

Hemofagocytos rapporterades i den diagnostiska benmärgsrapporten för alla 40 patienter med HLH, jämfört med 12 av 38 (32 %) i icke-HLH-gruppen (P<0,01). Även om bevis på hemofagocytos kan vara lugnande för kliniker när de ställer diagnosen HLH är hemofagocytos inte ett krav. I vår kohort uppfyllde majoriteten av de patienter som slutligen fick diagnosen HLH (73 %) fem eller fler kriterier oberoende av bevis på hemofagocytos i benmärgsaspirat (tabell 1). 9 patienter (23 %) i HLH-gruppen och 8 patienter (21 %) i icke-HLH-gruppen uppfyllde dock 4 kriterier exklusive hemofagocytos, vilket tyder på att morfologisk bedömning av benmärgsaspirat var avgörande för diagnosen hos 22 % av de patienter som uppvisade kliniska drag som gav anledning till oro för HLH.

Två patienter i HLH-gruppen uppfyllde färre än 5 av HLH-2004-kriterierna; båda dessa patienter var dock kirurgiskt aspleniska och resten av deras kliniska och laboratoriefynd, inklusive förekomsten av hemofagocytos på benmärgsaspirat, var förenliga med diagnosen. Fyra patienter i icke-HLH-gruppen uppfyllde fem kriterier men fick inte diagnosen HLH. De behandlande läkarnas kliniska anteckningar visar att symtomens kronicitet ansågs vara oförenlig med HLH. Ingen av dessa patienter hade hemofagocytos identifierad i benmärgen.

Utveckling av prediktiva modeller för en morfologisk diagnos av hemofagocytisk lymfohistiocytos

Patienter som diagnostiserats med HLH (n=40) uppvisade signifikant högre värden av totala hemofagocyter och hemofagocyter med någon av cellinjerna (RBC, nRBC, granulocyter och lymfocyter) jämfört med patienter som inte hade HLH (n=38) (P<0.001 för alla lineage) (figurerna 1 och 3). Korrelationsanalys visade att vart och ett av de kliniska och laboratoriekriterierna som ingår i HLH-2004-kriterierna (utom NK-funktionen) har en signifikant positiv korrelation med det totala antalet hemofagocyter och hemofagocyter med var och en av de enskilda cellinjerna, vilket tyder på att graden av hemofagocytos korrelerar med diagnosen HLH (Online Supplementary Figure S1).

Oavhängigt av varandra skiljde varje linjesträckning ganska väl mellan HLH och icke-HLH. Ingående nRBC och ingående granulocyter hade den högsta arean under kurvan (AUC), vilket indikerar en hög grad av korrekt klassificering av HLH- och icke-HLH-ämnen (AUC: 0,92), med tröskelvärden på 2 ingående celler respektive 1 ingående cell. Summan av alla fyra linjerna gav också bra resultat när det gällde att skilja mellan HLH och icke-HLH med ett tröskelvärde på 6 (AUC: 0,92, 95 %CI: 0,85, 0,98).

Dichotomiserar man varje linje baserat på de tröskelvärden som beskrivs ovan och inkluderar alla fyra i ett beslutsträd, valdes hemofagocyter som intar granulocyter som den viktigaste prediktoren för HLH, följt av nRBCs och lymfocyter (figur 4A). Patienter med avsaknad av hemofagocyter som intar granulocyter hade 3 % chans att få en HLH-diagnos. Patienter med minst en hemofagocyt med en intagen granulocyt, två eller fler hemofagocyter med intagna nRBC och en hemofagocyt med intagna lymfocyter tillsammans garanterades ha en HLH-diagnos (100 % chans). Korsvaliderad (CV) AUC för denna CART var 0,90; 95%CI: 0,83-0,97.

Identifiering av lymfocyter inom HPC är sällsynt, även i närvaro av florid HLH. Det högsta antalet HPC som innehöll lymfocyter identifierades hos en patient med DLBCL och baserat på morfologin representerade de sannolikt intagna tumörceller. Dessutom är det svårt att skilja mellan nukleerade erytrocyter, lymfocyter och hematopoetiska progenitorceller i cytoplasman hos en histiocyt och det är svårt att tolka dem på olika sätt. Därför har vi skapat ytterligare en CART som utesluter lymfocyter. Denna CART är identisk med de två första nivåerna i den tidigare modellen, där patienterna har 92 % chans att få en HLH-diagnos med närvaro av minst en hemofagocyt med en intagen granulocyt och två eller fler hemofagocyter med intagna nRBCs (figur 4B). Även om CV AUC var identisk med den första var den totala noggrannheten något högre i CART utan lymfocyter (88 % CV noggrannhet jämfört med 86 %).

Kvalitativ utvärdering

I den första beskrivningen av virusassocierat hemofagocytärt syndrom beskrevs histiocyter som var ”fyllda” med intagna hematopoetiska element.11 Vi observerar ofta fenomenet med flera nukleerade celler inom enskilda histiocyter hos patienter med etablerad HLH och antog att detta fynd kan indikera ett patologiskt hemofagocytiskt tillstånd. För att utvärdera betydelsen av graden av hemofagocytos inom enskilda hemofagocyter analyserade vi närvaron av multipla nukleerade celler inom histiocyter (figur 1). Vår analys visade slutligen att minst en hemofagocyt som innehöll multipla nukleerade celler identifierades hos 37 patienter med HLH jämfört med endast 4 patienter i icke-HLH-gruppen (AUC: 0,91, 0,845-0,947), vilket indikerar att denna binära kvalitativa egenskap fungerar på samma sätt som de kvantitativa mått som beskrivs ovan för att särskilja patienter med HLH från icke-HLH-patienter (tabell 3).

Diskussion

Med tanke på diagnosens sällsynthet och den ospecifika kliniska presentationen är HLH en utmanande diagnos för kliniker och patologer. När den väl betraktas som en differentialdiagnos är det vanligt att man gör en snabb undersökning med utvärdering av varje HLH-2004-kriterium, eftersom ett tidigt terapeutiskt ingripande förbättrar utgången för dessa ofta kritiskt sjuka patienter. Tyvärr finns det inget definierat tröskelvärde för att uppfylla det diagnostiska kriteriet hemofagocytos i benmärgen och evidensbaserade riktlinjer för rapportering av fynd har inte fastställts.

För att uppnå detta mål utformade vi denna retrospektiva studie för att fastställa om kvantitativa kännetecken för hemofagocytos vid tidpunkten för den initiala bedömningen av benmärgen är prediktiva för den slutgiltiga diagnosen HLH hos patienter som uppvisar kliniska kännetecken som är relevanta för diagnosen. Med tanke på att HLH klassiskt sett uppvisar en cytopeni i flera led som tros bero på att aktiverade makrofager förbrukar hematopoetiska celler12 , misstänkte vi att patienter med HLH skulle vara mer benägna att uppvisa hemofagocytos av nukleerade erytrocyter, granulocyter och lymfocyter jämfört med patienter utan HLH. Förutom att utvärdera eventuella kvantitativa skillnader i hemofagocytos bedömde vi samtidigt närvaron av flera nukleerade celler inom en enda hemofagocyt som en kandidat till binärt morfologiskt kännetecken som kan särskilja patienter med patologisk hemofagocytos.

Sammantaget fann vi att patienter med HLH uppvisade ett signifikant högre antal HPC:er av var och en av de undersökta linjesträckningarna (tabell 3). Vi identifierade också kvantitativa tröskelvärden som kan användas för att korrekt diagnostisera de flesta fall av HLH: en granulocyt eller två nukleerade erytroida celler per 1000 nukleerade celler. Dessutom använde vi klassificerings- och regressionsträdsanalys för att identifiera den bästa kombinationen av variabler för att skapa en ännu mer specifik och prediktiv modell för att särskilja patienter med HLH. Slutligen visade vi att närvaron av flera nukleerade celler inom en enda hemofagocyt var ytterligare prediktivt för en diagnos av HLH bland patienter som presenterade kliniska fynd som gav anledning till oro för sjukdomen.

Den första beskrivningen av virusassocierat hemofagocytiskt syndrom (VAHS) beskrev florid hemofagocytos i 19 fall av immunsupprimerade och tidigare friska patienter som presenterade kliniska drag som var kompatibla med HLH.11 I 60 på varandra följande benmärgsaspirat som användes som jämförelse fann de erytrofagocytos i 29 av 60 fall; graden av fagocytos var dock ”aldrig av en grad som kan förväxlas med VAHS”. Denna studie, som genomfördes före utvecklingen av HLH-2004-kriterierna, gav de första beläggen för sambandet mellan hemofagocytos och VAHS (det som vi nu kallar HLH) och visade att erytrofagocytos ofta konstateras i benmärgsaspirat från patienter utan HLH, vilket visar på en bristande specificitet vid isolering av de kliniska fynden.

Vi genomförde en liknande icke-blindad utvärdering av 87 benmärgsaspirat från patienter med de novo och efterbehandling av myeloida och lymfoida maligniteter, godartade cytopenier och negativa stagingmarker, och identifierade övervägande erytrofagocytos av mogna röda blodkroppar i 39 % av dessa fall. Genom att tillämpa det kvantitativa tröskelvärde som bestämts från vår analys för uppslukade icke-nukleerade röda blodkroppar (erytrofagocyter) på detta dataset finner vi att endast 3 av de 87 patienterna (5 %) skulle uppfylla detta morfologiska kriterium (4 per 1000 celler). Om vi tillämpar det kvantitativa tröskelvärdet för granulocyter (1 per 1 000 celler) skulle endast 4 av 87 patienter (4 %) uppfylla detta morfologiska kriterium. Även om vi faktiskt kan hitta sällsynta exempel på erytrofagocytos i aspiratutstryk i en stor minoritet av fallen, avslöjar tillämpningen av kvantitativa tröskelvärden en låg förekomst av kliniskt signifikant hemofagocytos i en patientpopulation som återspeglar de patienter som ses i rutinmässig diagnostisk praxis.

I en nyligen genomförd studie av Ho et al. undersöktes hemofagocytosens specificitet för HLH genom att kvantifiera den absoluta mängden hemofagocytos som identifierades i benmärgsaspirat från patienter vars diagnostiska patologirapport beskrev hemofagocytos.10 De visade att närvaron av hemofagocytos, även om den förekommer i stor mängd, saknar specificitet för HLH. Vår institutionella erfarenhet överensstämmer med deras slutsats att betydande hemofagocytos inte är förutsägande för diagnosen HLH i avsaknad av kliniska drag som ger anledning till oro för sjukdomen; förekomsten av betydande hemofagocytos är dock ett relativt sällsynt fynd. Incidentell hemofagocytos rapporterades i 86 av 8097 (1,1 %) interna benmärgsbiopsirapporter vid Stanford University Hospital från 2013-2017. Majoriteten av rapporterna anger ”sällsynt” hemofagocytos (61 %) medan resten beskriver ”spridd”, ”tillfällig” eller ”livlig” hemofagocytos. En delmängd (n=12) av dessa senare fall granskades. Samtliga 12 fall uppvisade erytrofagocytos. Hälften av fallen uppvisar intagna granulocyter och 3 fall uppvisade flera nukleerade celler inom enskilda HPC:er. Ingen av dessa patienter fick slutligen diagnosen HLH.

En stor begränsning i denna studie är dess retrospektiva karaktär. Vår population är begränsad till patienter där den kliniska diagnosen utvärderades grundligt och ett slutgiltigt beslut fattades om diagnosen HLH. Vi uteslöt patienter där den slutgiltiga diagnosen var tvetydig. Dessutom, även om vår kohort omfattar alla patienter vid vår institution som uppfyllde kriterierna för utvärdering, inklusive barn, hade endast en enda patient i vår kohort en homozygot mutation med diagnostik av primär HLH, vilket begränsar tillämpligheten av våra resultat på patienter med genetiska former av sjukdomen. Slutligen noterar vi att även om CD107a-testning har beskrivits som ett känsligare test för primär HLH,13 användes inte denna nyligen utvecklade test i denna retrospektiva kohort.

I slutändan vilar diagnosen HLH på en grundlig bedömning av patienterna i ett lämpligt kliniskt sammanhang. På samma sätt kräver en mikroskopisk undersökning av utdrag från benmärgsaspirat hos patienter som misstänks ha HLH en noggrann utvärdering av förekomsten av hemofagocytos. Våra resultat visar att kvantitativa tröskelvärden för de intagna cellernas härstamning, antingen ensamma eller i kombination, exakt förutsäger den slutliga diagnosen HLH. Vi visar dessutom att identifiering av en enskild hemofagocyt som innehåller flera nukleerade hematopoietiska celler i sin cytoplasma fungerar på samma sätt som vårt kvantitativa tillvägagångssätt. Med extern validering och ytterligare prospektiva studier hoppas vi att dessa data kommer att bidra till att tillhandahålla en metod för patologer och kliniker att systematiskt utvärdera och korrekt klassificera patienter med HLH och bidra till upprättandet av konsensusriktlinjer för diagnos och rapportering.

Footnotes

↵* BAM och RSO bidrog i lika hög grad till detta arbete.
Kontrollera online-versionen för den mest uppdaterade informationen om denna artikel, online-tillägg och information om författarskap & avslöjanden: www.haematologica.org/content/103/10/1635

Received December 17, 2017.
Accepted June 13, 2018.

Universe