Guanidin

Membranproteiner

Guanidin och SDS-lösningar är denaturerande lösningsmedel, men vi ville naturligtvis också karakterisera membranproteinernas ursprungliga tillstånd. Svårigheten här var att det ännu inte fanns någon konsensus om hur man skulle definiera eller uppfatta det nativa tillståndet – vilket för nykomlingar som oss innebar osäkerhet, eftersom vi inte hade den typ av erfarenhet som skulle göra det möjligt för oss att göra en smart gissning om vilken av de motstridiga idéerna som sannolikt skulle visa sig vara riktig.

Även fosfolipiddubbelskiktet, det enda oumbärliga begreppet för den mest minimala förståelsen av cellmembran, var fortfarande omtvistat, trots att det först hade påvisats i röda blodkroppar nästan 50 år tidigare och att det egentligen var det enda tänkbara arrangemanget på grundval av termodynamiken, en direkt följd av Irving Langmuirs klassiska mätningar från 1917 med monolager av amfifila ämnen. Jag har beskrivit den löjligt långsamma acceptansen av tvåskiktskonceptet under den mellanliggande perioden i min bok Ben Franklin Stilled the Waves . Poängen här är att skepticismen fortfarande fanns kvar när vi engagerade oss i membranforskning.

Och bland dem som var övertygade om lipiddubbelskiktet var sättet att införliva proteiner i membraner fortfarande öppet för debatt. Vissa, som vår Duke-kollega David Robertson, var tveksamma till att tro att proteiner faktiskt skulle kunna penetrera eller korsa ett bilager. Två helt olika konceptuella bilder, tagna från en konferens vid New York Academy of Sciences 1972, visas i figur 3 . Den ena är Robertsons ”enhetsmembran” med protein helt på utsidan. Den andra visar Vanderkoois bild av cytokromoxidasekomplex i mitokondriella membran: proteinet är placerat på ett mer realistiskt sätt, men det finns ännu ingen föreställning om distinkta hydrofila och hydrofoba domäner och hur de skulle kunna diktera interaktionen mellan protein och lipid. Senare samma år 1972 blev den nu konventionella idealiserade bilden av fosfolipidbilayers, med fungerande proteiner som löper hela vägen genom dem, slutligen populariserad genom Singer och Nicolsons ”fluid mosaik”-modell .

Figur 3. Två disparata konceptuella bilder av membranproteiner, som båda föreslogs vid samma möte i New York 1972 : (a) Robertsons tanke att proteinerna skulle vara asymmetriskt placerade, utanför de två bilagerytorna; (b) Vanderkoois bild av cytokromoxidasekomplex i tvärsnitt.

I laboratoriet var detta spännande tider, de mest spännande jag kan minnas. Vi lärde oss att använda godartade detergenter som, till skillnad från SDS, kunde lösa upp membranproteiner utan grov denaturering, i en miljö som simulerar det nativa tillståndet, men en miljö där de också skulle vara lättillgängliga för molekylär karaktärisering – ett framsteg som vi delvis föregicks av två sympatiska unga män från Finland, Kai Simons och Ari Helenius .

I praktiken var vi fortfarande mestadels begränsade till att mäta molekylvikten och fråga hur många polypeptidkedjor per molekyl, men de proteiner som dessa frågor gällde hade genom detergentbehandling separerats från andra membrankomponenter. Viktigast av allt är att många av proteinerna hade kända cellulära funktioner och att våra mätningar var relevanta för dessa funktioner. Jag har redan nämnt röda blodkroppar, men vi lyckades faktiskt täcka in en rad biologiskt relevanta ämnen, vilket i många fall sporrades av studenternas missionerande iver. Till exempel kom en doktorand i fysiologi, Stuart Grefrath, med intresse för neurofysiologi, till vårt laboratorium för att räkna upp polypeptidkedjorna i ett exciterbart membran – i det här fallet från garfishs luktnerv – och detta ledde till att vi senare engagerade oss i flera andra aktiva transportsystem. (Stuart själv dog tyvärr till följd av en medfödd hjärt- och kärlsjukdom innan han kunde uppfylla sitt tidiga löfte om en självständig karriär). Cerebralt myelin var ett annat membran från nervsystemet som vi tittade på .

Också värda att lyfta fram är två besökare till laboratoriet som valde att arbeta tillsammans: Neal Robinson, en postdoktoral stipendiat, och Leon Visser, som var på sabbatsledighet från CSIR i Pretoria, Sydafrika). De gjorde ett mycket snyggt arbete med att kvantitativt definiera domänstrukturen hos cytokrom b5, ett slags prototyp för att illustrera hur membranproteiner fästs vid membraner och ändå utför sin funktion i den angränsande cytoplasman .

I andra projekt svarade vi på förfrågningar från avlägsna kollegor. Jag har redan nämnt arbetet med Arthur Karlin om acetylkolinreceptorn från en elektrisk fisk. Ett annat exempel var bakteriorhodopsin, för vilket vi gjorde mätningar i detergentlösning på begäran av Walter Stoeckenius från University of California . Det fanns en viktig fråga här, relaterad till mekanismen för detta proteins protonpumpningsaktivitet: är det ursprungliga proteinet funktionellt en monomer eller (vilket vissa uppgifter tycktes antyda) är det en trimer? Vårt solubiliserade protein var utan tvekan en monomer och spektrala bevis visade att det genomgick samma cykel av molekylära förändringar som i det nativa membranet.

I de flesta fall blev vi själva inte direkt involverade i försöken att pussla ut hur receptorer eller pumpar eller kanaler fungerade, men vi blev oundvikligen medvetna om vad problemen var. Det var en verkligt berikande erfarenhet, en stor skillnad från de dagar då serumalbumin och β-laktoglobulin (som erhölls från kommersiella leverantörer) var de främsta målen för vår forskning.

I fallet med jonpumpar gick vi faktiskt in i fysiologin, mestadels på hypotes- eller teorinivå; vi lärde oss att modellera kinetiska scheman med en dator; vi deltog i lämpliga konferenser, osv. Vår sista sabbatsledighet – till Max Planck-institutet i Heidelberg – var viktig i detta avseende. Ordföranden för fysiologiavdelningen vid Duke, Ted Johnson, anslöt sig till oss vid detta tillfälle, så vi var tre personer som samarbetade aktivt . Ted hade länge varit en datorentusiast och hade kopplat varje enskild medlem av den fysiologiska fakulteten till den centrala datoranläggningen North Carolina Research Triangle innan det blev modernt att spendera avdelningsmedel på det sättet. På den tiden var vi tvungna att skriva våra egna program för datorn, vilket var svårt för mig, men jag tror att vi fick en del användbara resultat, främst om kinetiska modeller för pumpcykeln för den ATP-drivna Na,K-pumpen. Vi arbetade på oortodoxa arbetstider, inklusive helger och helgdagar, vilket ibland gjorde våra värdar i Heidelberg besvikna, som var vana vid att stänga av centralvärmen när laboratoriet skulle vara obemannat. Ungefär var tionde dag körde vi över gränsen till Strasbourg för en gourmetlunch – tillsammans med Alsace-viner, vars smak vi har njutit av sedan dess.