Genomisk differentiering och interkontinental populationsstruktur hos myggvektorerna Culex pipiens pipiens och Culex pipiens molestus

Oberoende monofyletiskt ursprung för Culex pipiens pipiens och Culex pipiens molestus

Två alternativa hypoteser har föreslagits för att förklara skillnaderna i ekologiska och fysiologiska strategier hos Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus19. Den ena hypotesen förklarar en sådan differentiering som en snabb förändring av fysiologiska och beteendeegenskaper som en anpassning till en underjordisk miljö som är förknippad med mänsklig verksamhet22. I detta scenario måste de lokala populationerna av Cx. p. molestus vara nära besläktade med de lokala populationerna av Cx. p. pipiens30. I detta scenario betraktas Cx. p. molestus som en ekofysiologisk variant av Cx. p. pipiens. Enligt en alternativ hypotes är skillnaden mellan Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus ett resultat av skillnaden i deras evolutionära historia. De ekologiska och fysiologiska strategierna hos Cx. p. molestus kan ha uppstått i det varma klimatet19. Senare visade sig en sådan strategi vara relevant på grund av mänsklig verksamhet som skapade en underjordisk miljö och därmed spred Cx. p. molestus över hela världen. I detta scenario betraktas Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens som separata evolutionära enheter.

I vår studie testade vi dessa hypoteser med hjälp av helgenomanalys av 40 prover av Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens som samlats in från fyra platser i Eurasien och Nordamerika. Våra resultat förkastade hypotesen om en återkomst av Cx. p. molestus från lokala populationer av Cx. p. pipiens och stödde starkt idén om ett oberoende monofyletiskt ursprung för både Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus från olika kontinenter. NJ- och ML-analyser grupperar separat Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus från Vitryssland, Kirgizistan och Chicago, IL, USA (figur 2, kompletterande figurer 1-3). Förekomsten av ytterligare ett hybridkluster bestående av autogena och anautogena fältinsamlade exemplar från Washington, D.C., USA, återspeglar mer sannolikt förekomsten av en hybridzon mellan Cx. pipiens och Cx. quinquefasciatus i detta område16. Baserat på genetiska avstånd är detta kluster dock mycket närmare besläktat med den eurasiska Cx. p. pipiens än med Cx. p. molestus från Eurasien och USA (Chicago, IL). Dessutom identifierade PCA- (fig. 3) och ADMIXTURE-analyser (fig. 4) två olika genetiska kluster som motsvarar Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus. I båda fallen klustrade alla exemplar från Washington D.C. tillsammans med Cx. p. pipiens från andra platser. Genombredda parvisa Fst-värden var mycket signifikanta för alla jämförelser (fig. 5). Vi identifierade inte någon specifik region med hög divergens i genomet (fig. 6). Överlag var Fst-värdena mycket högre mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens än mellan autogena och anautogena prover av Cx. p. pipiens från Washington, D.C. Den mest divergerande gruppen, baserat på alla genomförda analyser, var stammen av Cx. p. pipiens. molestus från Chicago, IL, vilket kan förklaras av den mycket låga genetiska mångfalden hos denna stam på grund av dess långvariga kolonisering och eventuella flaskhals, vilket påskyndade den genetiska driften (fig. 7).

Samma observationer om det oberoende monofyletiska ursprunget hos Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens erhölls med hjälp av mikrosatellitanalyser av ~600 prover av Cx. pipiens-myggor som härstammade från olika platser över hela världen19. Det orotade avståndsträdsförfarandet grupperade ovanjordiska populationer av Cx. p. pipiens och underjordiska populationer av Cx. p. molestus från Nord- och Sydeuropa separat. I likhet med vår studie bildade de ovanjordiska populationerna av Cx. p. pipiens från USA ytterligare ett kluster, vilket tyder på en mer intensiv hybridisering mellan medlemmarna i Cx. pipiens-komplexet i Nordamerika. Blandningsanalysen visade att det fanns tre stora kluster som motsvarade Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens och Cx. quinquefasciatus. Det sistnämnda klustret hittades i denna studie endast i proverna från USA. I ett annat arbete baserat på AFLP-analyser (amplified fragment length polymorphism) jämfördes prover från södra och norra Europa och stammar från Chicago, IL, USA24. De nordamerikanska och europeiska populationer som användes i denna studie uppvisade ett liknande ADMIXTURE-mönster i AFLP-genomsökningen. Analysen av COI-gener visade också på ett monofyletiskt ursprung för Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus i Europa, Asien och Afrika26.

Det oberoende monofyletiska ursprunget och den höga graden av genetisk divergens mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens tyder alltså på att dessa två medlemmar av Cx. pipiens-komplexet utgör skilda fylogenetiska enheter med oberoende evolutionära historier före den av människan förmedlade translokaliseringen.

Koncept för artbildning och evolution av Culex pipiens-komplexet

De teoretiska modellerna för artbildning hos djur skulle kunna delas in i två huvudgrupper: allopatrisk eller geografisk artbildning och sympatrisk eller ekologisk artbildning. Det första konceptet för artbildning, som intensivt förespråkades av E. Mayr3, föreslår att begynnande taxa först blir geografiskt isolerade. Denna situation minskar genflödet mellan populationerna och kan leda till ackumulering av mutationer som orsakar genetisk inkompatibilitet mellan hybriderna. Ett alternativt koncept för artbildning betonar de ekologiska barriärerna mellan de framväxande taxa som viktiga drivkrafter för evolutionen31. I detta scenario beaktas utvecklingen av reproduktiv isolering mellan populationerna som ett resultat av anpassning till olika miljöer utan geografisk isolering, vilket vanligtvis sker i samband med genflöde. I denna situation blir hybriderna mellan begynnande taxa mindre anpassade till miljön, vilket främjar det naturliga urvalet av egenskaper som minskar parningen mellan dem. Vi anser att den övergripande diversifieringen av underarterna Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus utgör ett slående exempel på artbildning genom mekanismer för isolering genom ekologi. I vår studie fastställde Fst-analysen betydande nivåer av genomisk divergens mellan Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus (fig. 5 och 6) över hela genomet utan tydliga öar av artbildning. Överraskande nog var differentieringsnivåerna lägre runt centromererna, vilket troligen beror på det låga antalet tillförlitliga SNV:er i dessa mycket repetitiva regioner. Differentieringen var extremt hög mellan stammarna från Chicago, IL, USA av Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus, men var lägre mellan underarterna i de eurasiska myggsamlingarna. Sammantaget tyder dessa observationer på en betydande begränsning av genflödet mellan underarterna.

Flera mekanismer för reproduktiv isolering mellan Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus har beskrivits17. Två av dem är prezygotiskt agerande, före befruktning, och minskar möjligheterna till myggparning. Den första mekanismen är relaterad till larvernas habitatspecialisering: Cx. p. molestus upptar källare eller andra underjordiska miljöer, medan Cx. p. pipiens föredrar öppna ovanjordiska vattenförekomster som fortplantningsplatser. Detta minskar chanserna för de två underarterna att mötas och para sig i vuxenstadiet. Den andra isoleringsmekanismen bygger på skillnaderna i parningsbeteende mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens. Cx. p. molestus-hannar bildar vanligtvis homogena svärmar nära marken och behöver begränsat utrymme för att para sig17. Däremot svärmar Cx. p. pipiens-hannar nära lövverket ca 2-3 m över marken. Experimentella studier av parningsbeteende i små burar visade att i korsningar mellan honor och hanar av Cx. p. molestus var copulationsframgången 90 %, medan den hos Cx. p. pipiens endast var 3,3 %32. I korsningar mellan underarter mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens var också kopulationsframgången låg och varierade mellan 6,6 % och 10 % beroende på underarternas kön. Denna studie visade att honor av båda underarterna aktivt undviker att kopulera med hanar från en alternativ underart. Dessutom misslyckades Cx. p. pipiens honor med att ta emot spermier från Cx. p. molestus och producerade därför inga ägg.

Två andra reproduktiva isoleringsmekanismer som beskrivs för Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus är postzygotiska, de verkar efter parningen och resulterar i minskad fitness hos hybriderna. En av mekanismerna är relaterad till nedärvningen av diapause hos hybrider av Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens som en recessiv egenskap8. F1-hybrider och en betydande del av F2-hybriderna kan inte utveckla diapause och kan inte överleva under vinterförhållanden. Denna mekanism kan kanske förklara de högre introgressionsnivåerna hos Cx. p. pipiens på sydliga platser19,23,24. Slutligen utsätts medlemmarna i Cx. pipiens-komplexet för cytoplasmatisk inkompatibilitet hos hybrider som infekterats med olika stammar av rickettsiaparasiten Wolbachia pipientis. Trots cytoplasmatisk introgression av denna parasit genom hybridisering mellan medlemmarna i Cx. pipiens-komplexet33 kan cytoplasmatisk inkompatibilitet avsevärt begränsa hybridernas överlevnad. Till exempel minskade W. pipientis-infektion avsevärt hybridiseringen mellan Cx. pipiens och Cx. quinquefasciatus i Sydafrika34. En annan studie visade att i eurasiska populationer infekterades Cx. p. molestus endast av en stam av W. pipientis men Cx. p. pipiens av två olika stammar35. De exemplar av Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens som vi använde i vår studie infekterades dessutom av samma stammar av W. pipientis i södra Kirgizistan men av olika stammar i norra Vitryssland. Detta kan således förklara skillnaderna i introgression från Cx. p. molestus till Cx. p. pipiens som var mer uttalad i Vitryssland än i Kirgizistan. Ett intressant exempel på smittsam artbildning har faktiskt beskrivits i det sydamerikanska Drosophila paulistorum-komplexet. I detta komplex blev sex halvarter med överlappande geografisk utbredning reproduktivt isolerade till följd av isolering före och efter parning som utlöstes av Wolbachiae-infektionen36.

Nyligen genomförda genomiska studier som utförts på olika organismer, bland annat Drosophila simulans37, Rhagoletis-fruktflugor38,39 och Heliconius-sfjärilar40,41 , ger ytterligare bevis för att ekologisk artbildning förekommer i naturen. De genomiska mönstren för artbildning kan vara mycket olika2 och sträcka sig från små genomiska öar av artbildning40 till betydande divergensnivåer över hela genomet. Utbredd genomisk divergens identifierades mellan de begynnande arterna Anopheles gambiae och An. coluzzii i An. gambiae-komplexet42. Dessa arter identifierades ursprungligen genom skillnader i strukturen av deras ribosomala DNA som S- och M-former43, men senare höjdes deras taxonomiska status till artnivå44. An. gambiae och An. coluzzii tros utveckla reproduktionshinder i sympati som ett resultat av skillnaderna i deras ekologiska preferenser45. An. gambiaes larvstadium är förknippat med små regnbassänger. An. coluzzi däremot utnyttjar ihållande vattenreservoarer i samband med risodling. Även om barriärerna mellan arterna inte är fullständiga46 har de utvecklat skillnader i sitt svärmbeteende47,48 och divergerande sångtyper49.

En hög nivå av genomövergripande divergens, en slående skillnad i anpassning till olika ekologiska miljöer och bevis för prezygotiska och postzygotiska barriärer för parning tyder alltså på att Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus utgör skilda ekologiska enheter som genomgår en begynnande ekologisk artbildning.

Hybridisering i Culex pipiens-komplexet

Den mest fascinerande observationen av medlemmarna i Cx. pipiens-komplexet är att de, trots skillnader i ekologi, fysiologi, beteende och geografisk utbredning, fortfarande kan hybridisera och producera livskraftig avkomma i naturen, vilket tyder på att den reproduktiva isoleringen mellan dem inte är fullständig. Vår studie visade också på betydande hybridiseringshändelser mellan underarterna Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens. En jämförelse av hela arvsmassan visade att de flesta prover av Cx. p. pipiens representerar individer med en viss grad av introgression från Cx. p. molestus (fig. 4). Vi observerade en stor diskrepans mellan de nukleära och mitokondriella fylogenierna (fig. 2, 8), vilket tyder på att överföring av mitokondriella genom historiskt sett kan ske mellan underarterna. Samtidigt observerade vi inga haplogrupper som delas mellan underarternas lokala populationer. På kontinenterna var alla mitokondriella fylogenier starkt monofyletiska, vilket pekar på spridning och hybridisering med hjälp av hanar. Blandningen med Cx. p. molestus var högre i sydliga populationer av Cx. p. pipiens i Kirgizistan och i Washington, D.C., USA, men lägre i nordliga populationer i Vitryssland och Chicago, IL, USA. Detta kan bero på att hybriderna inte kan utveckla diapause i kallt klimat. Som jämförelse visade mikrosatellitanalys en blygsam nivå av hybridisering mellan Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus på ~8 % i de nordliga städerna i USA (Chicago, IL och New York, NY)30,50. I södra Europa, där Cx. p. pipiens och Cx. p. molestus båda kunde hittas ovan jord, var hybridiseringsnivåerna mellan dem liknande och uppskattades till 8-10 %51. Mycket högre hybridiseringsnivåer hittades i sydliga populationer i östra USA, där ~40 % av alla prover identifierades som hybrider mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens19. Således var den totala hybridiseringsgraden mellan medlemmarna av Cx. pipiens högre i Nordamerika än i den gamla världen. Som jämförelse kan nämnas att hybridiseringen mellan kryptiska arter i An. gambiae-komplexet (An. gambiae och An. coluzzi) varierade signifikant mellan 1 % i Mali46 och >20 % i Guinea-Bissau52 , vilket är jämförbart med de totala hybridiseringsnivåerna mellan Cx. p. molestus och Cx. p. pipiens.

Intressant nog kunde vi i vår studie inte fastställa någon Cx. p. pipiens-blandningssignatur i några Cx. p. molestus-prover från Vitryssland, Kirgizistan och Chicago, IL, USA (fig. 4). Dessa resultat visar på ett mycket begränsat eller inget genflöde från Cx. p. pipiens till Cx. p. molestus. Liknande resultat av asymmetrisk introgression från Cx. p. molestus till Cx. p. pipiens har visats i tidigare studier20,51. Mekanismen för asymmetrisk introgression är för närvarande okänd. En hypotes är att hanar av Cx. p. molestus, som kan para sig i trånga utrymmen, kan hybridisera med både Cx. p. molestus- och Cx. p. pipiens-honor. Däremot kan Cx. p. pipiens-hannar, som behöver utrymme för att svärma, är mer benägna att para sig med Cx. p. pipiens-honor51. Det behövs dock fler populationsgenetiska och experimentella studier för att förklara detta fenomen.

Slutligt visade vår studie att Cx. p. pipiens kan utveckla autogeni som ett resultat av adaptiv introgression av det genetiska materialet från Cx. p. molestus. I fält insamlade prover från ovanjordiska och underjordiska miljöer i Washington, D.C., USA, valde vi ut myggor för autogeni. De underjordiska myggorna var autogena men de ovanjordiska myggorna var anautogena. Myggor från både autogena och anautogena kolonier bildade dock ett enda kluster när grannföreningsanalys tillämpades (fig. 2). Dessutom klustrar PCA (fig. 3) och ADMIXTURE (fig. 4) dessa prover tillsammans med Cx. p. pipiens från andra platser. Populationer med blandade egenskaper har hittats i Europa51 och i USA53. I Portugal hittades också ett ovanligt mönster av blodätande beteende på fåglar hos Cx. p. molestus54.

Närvaron av pågående hybridisering mellan medlemmar av Cx. pipiens-komplexet tyder alltså på att artbildningsprocessen mellan dem inte är avslutad och att postzygotiska barriärer för reproduktiv isolering inte är fullt ut bildade. Sammantaget anser vi att medlemmarna i Cx. pipiens-komplexet utgör en anmärkningsvärd modell för att studera olika aspekter av geografisk och ekologisk artbildning med tanke på det pågående genflödet mellan dem och lokala anpassningar till olika miljöer.