Gelfiltreringskomatografi

Gelfiltreringskomatografiska tillämpningar

Gelfiltreringskromatografi, en typ av storleksexkluderingskromatografi, kan användas för att antingen fraktionera molekyler och komplex i ett prov i fraktioner med ett visst storleksintervall, för att avlägsna alla molekyler som är större än en viss storlek från provet, eller en kombination av båda operationerna. Gelfiltreringskromatografi kan användas för att separera föreningar som små molekyler, proteiner, proteinkomplex, polysackarider och nukleinsyror i vattenlösning. När ett organiskt lösningsmedel används som rörlig fas kallas processen i stället för gelpermeationskromatografi.

Gelfiltreringskromatografi kan också användas för:

• Fraktionering av molekyler och komplex inom ett förutbestämt storleksintervall
• Storleksanalys och -bestämning
• Borttagning av stora proteiner och komplex
• Bufferutbyte
• Saltnedbrytning
• Borttagning av små molekyler, t.ex. nukleotider, primers, färgämnen,
• Bedömning av provets renhet
• Separation av bundna från obundna radioisotoper

Gelfiltreringskromatografimedier för alla ovanstående användningsområden finns tillgängliga i färdigförpackade gravitationsflödeskolonner, spin-kolonner, kromatografikolonner med lågt och medelhögt tryck samt harts på flaska.

Gelfiltreringskomatografimekanism

I en gelfiltreringskromatografikolonn består den stationära fasen av en porös matris, och den rörliga fasen är bufferten som flyter mellan matrispärlorna. Pärlorna har ett definierat porstorleksintervall, som kallas fraktioneringsintervallet. Molekyler och komplex som är för stora för att tränga in i porerna stannar i den rörliga fasen och rör sig genom kolonnen med buffertflödet. Mindre molekyler och komplex som kan ta sig in i porerna går in i den stationära fasen och rör sig genom gelfiltreringskolonnen genom en längre väg genom pärlornas porer.

Alla molekyler eller komplex som ligger ovanför fraktioneringsintervallet för en viss gelfiltreringskromatografikolonn kommer att röra sig genom kolonnen snabbare än alla molekyler som kan komma in i den stationära fasen. Därför kommer alla beståndsdelar i provet som ligger över fraktioneringsområdet att eluera först (i tomvolymen) före allt som ligger inom fraktioneringsområdet. Den minsta storlek som stannar kvar i den rörliga fasen och inte kommer in i den stationära fasen kallas uteslutningsgränsen. Bio-Rad erbjuder gelfiltreringskromatografimedia och kolonner med uteslutningsgränser som sträcker sig över tre storleksordningar, från 100 dalton till 100 000 dalton (100 kDa).

Molekyler och komplex som kan komma in i den stationära fasen kommer att fraktioneras enligt sin storlek. Mindre molekyler kommer att migrera djupt in i porerna och fördröjas mer än större molekyler som inte så lätt kommer in i porerna och därför elueras från kolonnen snabbare. Denna skillnad i porernas migration leder till fraktionering av komponenterna efter storlek där de största elueras först.

I gelfiltreringskromatografikolonner som är utformade för avsaltning, buffertutbyte och avlägsnande av små molekyler, t.ex. nukleotider, tränger salter och små föreningar lätt in i porerna, fördröjs och migrerar långsammare genom kolonnen än de större proteinerna eller nukleinsyrorna. Därför elueras de intressanta komponenterna i provet före salter, nukleotider osv. DNA-reningssatser som använder denna mekanism innehåller ofta spin-kolonner för gelfiltrering.

Upplösningen, som här definieras som skärpan i gränserna mellan storleksfraktionerna, bestäms av pärlstorleken och ett antal andra faktorer. Mindre pärlstorlek ger i allmänhet högre upplösning i en kromatografikolonn med gelfiltreringskromatografi. Kompakta molekyler diffunderar snabbare genom den stationära fasen än linjära molekyler. Storleksuteslutning, fraktioneringsområde och elutionshastighet påverkas av buffersammansättning, jonstyrka och pH-värde. För fraktionering av komplexa blandningar av proteiner kan elutionstider och gränser för storleksuteslutning behöva bestämmas empiriskt.

Gelfiltreringskromatografimedier

Ett viktigt kriterium för gelfiltreringskromatografimedier är att medierna är inerta och att ingenting i provet eller någon buffert binder till medierna. Ett annat övervägande är vilken typ av gelfiltreringskolonn som används och om den används i ett trycksatt kromatografisystem eller i gravitationsflödes- eller spin-kolonner. Om ett kromatografisystem med tryck används måste både kolonnen och medierna kunna tolerera det tryck och de flödeshastigheter som används.

De vanligaste medierna för gelfiltreringskromatografi är baserade på agaros- eller polyakrylamidpärlor, dextros för gravitations- eller lågtryckssystem och polymera hartsarmer för system med medelhögt tryck. Valet av media beror på egenskaperna hos de komponenter som ska separeras och andra experimentella faktorer. Följande är allmänna överväganden när man bestämmer valet av kromatografimedia för gelfiltreringskromatografi:

• Fraktioneringsområde
• Gräns för uteslutning av storlek
• Arbetstryck
• Flödeshastighet
• Provets viskositet
• PH-område
• Autoklaverbarhet
• Tolerans för vattenblandbara organiska lösningsmedel; Vissa prover kan vara mer lösliga i en vattenorganisk blandning
• Tolerans för tvättmedel, chaotropa ämnen, formamid etc.
• Operationstemperatur

Typerna av prover, valet av medier och kromatografisystemets uppbyggnad avgör vilka parametrar som är viktigast för en viss reningstillämpning.