Gamma-glutamyltranspeptidas

Aktivitet och specificitet

Den reaktion som katalyseras av detta enzym förstås därför i allmänhet som överföringen av en γ-glutamylgrupp till en mängd olika acceptörmolekyler, t.ex. vatten, aminosyror, dipeptider och γ-glutamyldonatorn själv, beroende på reaktionsförhållandena. Dessa katalytiska egenskaper är förknippade med GGT:s katalytiska mekanism, där reaktionen sker genom en acylering-deacylering dubbelförskjutningsmekanism via ett γ-glutamylenzymintermedium.

Som förväntat från strukturerna av det naturliga substratet glutation och dess derivat, känner GGT strikt igen γ-glutamyldelen, men har en ganska bred substratspecificitet med avseende på den avgående gruppen (Xaa). Glutation, dess S-konjugater, glutationdisulfid, γ-glutamyl di- eller tripeptider, glutamin, l-α-metylderivat av γ-glutamylamider, leukotrien C4, poly-γ-glutamylderivat accepteras alla som substrat . Konstgjorda substrat som l-γ-glutamyl-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) och fluorescerande l-γ-glutamyl-7-amino-4-metylkumarin (l-γ-Glu-AMC) är aktiva substrat som vanligen används i närvaro eller frånvaro av γ-glutamylacceptorer (se nedan) för transpeptidas- eller hydrolasbestämning.

Substratspecificiteten med avseende på acceptorn har studerats mest ingående med GGT från råttnjure. Isomererna av neutrala aminosyror som l-cystin, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys och l-Ser är goda acceptorer, men hydrofoba och grenade aminosyror som l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile och l-Val är ganska dåliga substrat. d-Aminosyror och α-substituerade aminosyror fungerar inte som acceptorsubstrat. Därför är användningen av d-γ-Glu-pNA ett lämpligt sätt att undertrycka autotranspeptidation vid mätning av hydrolasaktivitet . Eftersom acceptorbindningsstället överlappar med subsiterna för glutationens Cys-Gly-grupp föredrar enzymet dipeptider med Gly i C-terminalen, t.ex. l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly och l-Ser-Gly, som acceptorsubstrat i fallande ordning med avseende på den relativa aktiviteten . Peptider med mer än två aminosyrarester är mycket dåliga acceptörer. Km-värdena för de accepterande aminosyrorna och dipeptiderna är relativt höga och ligger inom intervallet 0,1-5 mM , men Gly-Gly (Km=3 mM) används lämpligast som ett accepterande substrat för transpeptidasaktivitet. Höga koncentrationer av acceptormolekyler hämmar GGT kompetitivt i förhållande till γ-glutamyldonatorn (γ-Glu-Xaa), troligen på grund av överlappningen mellan bindningsstället för Xaa och det för acceptorn. Substratspecificiteten med avseende på Cys-subplatsen beror på enzymets ursprung; E. coli-enzymet föredrar till exempel basiska aminosyror (l-Arg, l-Lys och l-His) och aromatiska aminosyror (l-Phe, l-Trp och l-DOPA) på denna plats. Acceptorspecificiteten måste dock beaktas med försiktighet, eftersom den synliga aktiviteten också beror på den effektiva koncentrationen av den deprotonerade aminosyra som finns tillgänglig vid det aktuella pH-värdet. Den relativt höga aktivitet som observerats med Gly-Gly beror delvis på denna dipeptids låga pKa . Deprotonerade aminogrupper i acceptorsubstrat tycks vara nödvändiga för transpeptidering.

Det mest använda donorsubstratet för enzymbestämning är l-γ-Glu-pNA. En typisk testblandning för transpeptidasaktivitet hos enzymet från råttans njure består av 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly i 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) vid 25 °C. Tillsatsen av en tillräcklig koncentration av Gly-Gly undertrycker effektivt hydrolys och autotranspeptidering. Det optimala pH-värdet för GGT är cirka 7,5-9 för transpeptidering, men pH-beroendet är mycket mindre för hydrolys. Detta stämmer överens med det faktum att den uppenbara transpeptidasaktiviteten delvis är beroende av den effektiva koncentrationen av acceptorernas fria aminogrupp .

Hydrolasaktiviteten för glutamin ökas med upp till 12-faldigt genom att man tillsätter acceptorplatsriktade modulatorer såsom maleat, hippurat och glykokolat. Tillsatsen av dessa föreningar hämmar bindningen av acceptorsubstrat och γ-glutamyldonatorer som ockuperar Cys-Gly-subsiterna. Tillsats av γ-glutamyldonatorer eller bindning av inhibitorer vid γ-glutamyldonatorplatsen ökar affiniteten hos dessa modulatorer, vilket tyder på kooperativa interaktioner mellan bindningsställena för γ-glutamyldonatorer och acceptorer (för en översikt se Tate & Meister ). Den acceptorplats som upptas av dessa modulatorer föreslås främja en konformationsförändring av GGT till en aktiv form, vilket underlättar bildandet av ett övergångstillstånd. Detta föreslås också förklara ökningen av inaktiveringshastigheten hos däggdjursenzymer med acivicin (vide infra), men detta observerades inte vid hämning med en γ-monofluorfosfonat, en aktivitetsställeinriktad övergångstillståndsanalog affinitetsmärkning . Acivicin tycks binda till en annan nukleofil rest än den katalytiska nukleofilen hos GGT från däggdjur .

GGT hämmas reversibelt och kompetitivt av l- och d-γ-glutamyl-(o-carboxy)fenylhydrazid (anthglutin, som produceras av Penicillium oxalicum) med en Ki på 8 μM, och ingen akut toxicitet har rapporterats för möss . Flera glutamatanaloger med en reaktiv grupp nära γ-karboxynoden fungerar som irreversibla hämmare. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), O-diazoacetyl-l-serin (l-azaserin) och l-(αS,5S)-α-amino-3-klor-4,5-dihydro-5-isoxazolättiksyra (acivicin eller AT-125, framställd av Streptomyces sviceus) är potenta, men ospecifika inaktiverare av GGT . Acivicin har använts i stor utsträckning för att undertrycka GGT-aktiviteten in vivo , även om acivicin är mycket giftigt genom att inaktivera ett antal glutaminamidotransferaser som är involverade i biosyntesen av nukleotider, aminosyror och aminosocker . Serinboratkomplexet är reversibelt bundet till γ-glutamylbindningsstället för att hämma GGT med en Ki på 20 μM . Detta klassiska fynd har lett till en potent och långsamt bindande hämmare, l-2-amino-3-boronobutansyra (γ-boroGlu) . GGT hämmas med en total Ki på 17 eller 35 nM, men hämmningen är fortfarande reversibel. 2-amino-4-(fluorfosfon)butansyra (γ-PFGlu), en glutamatanalog med en elektrofil fosfor som ersätter γ-karboxy, är en kraftfull mekanismbaserad och aktivitetsställeinriktad affinitetsmärkningsagent för E. coli GGT . Denna förening hämmar snabbt och irreversibelt GGT och bildar en stabil, anjonisk och tetraedrisk övergångstillståndliknande addukt, som är lämplig för peptidkartläggning för att identifiera E. coli GGT:s katalytiska nukleofil (vide infra). En serie γ-(monofenyl)fosfono- och γ-fosfonodiesterglutamatanaloger fungerar som mekanismbaserade hämmare som hämmar GGT irreversibelt genom kovalent modifiering av dess katalytiska nukleofil. Särskilt γ-fosfonodiester som innehåller den strukturella imitationen av Cys-Gly och dess C-terminala karboxygrupp uppvisar utomordentligt hög aktivitet mot humant GGT, med en inaktiveringshastighet som är 130-6000 gånger så snabb som den för acivicin. Hämningen är selektiv för GGT och ingen toxicitet har observerats. En av dessa hämmare är kommersiellt tillgänglig under namnet ”GGsTop” (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

En icke-glutamatanalog hämmare av humant GGT har hittats genom högflödesscreening . Denna förening upptar acceptorplatsen i γ-glutamylsubstratkomplexet med en Ki på 17,6 μM. Hämmaren är species-selektiv, men är reversibel och viss toxicitet rapporteras.

Den reaktion som katalyseras av GGT tros ske med en ping-pong-mekanism via en γ-glutamyl-enzymintermediär som observerats med serinhydrolaser . Den N-terminala Thr Oγ i den lilla underenheten är den katalytiska nukleofilen till vilken en γ-glutamylgrupp är knuten (se Strukturkemi). Den katalytiska nukleofilen i GGT identifierades för första gången med E. coli GGT som den N-terminala Thr-restigen (Thr391) i den lilla underenheten genom peptidkartläggning av enzymet inaktiverat med γ-PFGlu . Denna rest, som motsvarar Thr380 (njurenzym från råttor) och Thr381 (mänskligt enzym), är bevarad bland alla GGT:er vars primära sekvenser är kända. Den katalytiska nukleofilen i human GGT identifieras som Thr381 genom peptidkartläggning av enzymet som inaktiverats med γ-(monofenyl)fosfono-affinitetsmärkningen . Den reaktion som katalyseras av GGT börjar därför med den nukleofila attacken av den N-terminala Thr-restigen i den lilla underenheten på γ-karboxyn i ett givarsubstrat (γ-Glu-Xaa) för att eliminera Xaa. Det γ-glutamylenzym som bildas på detta sätt reagerar med vatten (hydrolys) eller med aminosyror och dipeptider (transpeptidering och autotranspeptidering) i det hastighetsbestämmande steget .

GGT tillhör de N-terminala nukleofila hydrolaserna (Ntn-hydrolaser) enligt förutsägelser från dess unika veckning och mognadsprocessen, där en aktiv dimerisk form av moget enzym genereras genom posttranslationell autokatalytisk bearbetning av den katalytiskt inaktiva prekursorn. Detta bekräftas genom platsstyrd mutagenes och röntgenstrukturanalys av bakteriella enzymer (se Strukturkemi).