Furin

De allmängiltiga konverteraserna Furin, PC7 och SKI-1/S1P

Furin, ett allmängiltigt membranprotein, produceras ursprungligen som en ∼104-kDa-prekursor och omvandlas snabbt till en aktiv ∼98-kDa-form. Denna autokatalytiska klyvning, som sker i ER, är en förutsättning för att mogna furinmolekyler ska kunna lämna ER till TGN och cellytan. Furin och PC5/6 tycks uppvisa partiell redundans när det gäller deras selektivitet för klyvning in vitro av ett antal substrat och känslighet för vissa modifierade serpinhämmare, t.ex. α1-PDX eller deras prosegmenter (fig. 6). De olika typerna av konstitutivt utsöndrade proteiner som bearbetas av de furinliknande konverteraserna exemplifieras i tabell 1. I det centrala nervsystemet ansvarar furin för bearbetningen av ett antal tillväxtfaktorer, inklusive neurotrofinerna pro-nerve growth factor (NGF) och brain derived neurotrophic factor (BDNF), samt neurala celladhesions- och cueingproteiner som L1-CAM och semaphoriner.

Inaktivering av furin-genen (Fur) hos möss är dödlig och döden inträffar vid embryodag 10,5-11 (E10,5-E11) på grund av hemodynamisk insufficiens och brister i hjärtats ventrala stängning. Mutantembryon misslyckades med att utveckla stora kärl trots förekomsten av endotelcellsförstadier. Transforming growth factor β1 har visat sig effektivt bearbetas av furin, och inaktivering av dess gen ger en fenotyp som liknar den hos furin-nollembryon. En villkorlig knockout i levern, med deletion av exon 2 som är beroende av Cre-uttrycket från Mx1-cre-transgenen, resulterade i livskraftiga Furflox/flox Tg(Mx1-cre)-möss med nästan ingen fenotyp. Detta visade på en viss redundans med andra PC eftersom vissa typiska furinsubstrat klyvdes i mindre utsträckning.

Som skillnad från de andra PC-nollmössen visade flera studier på PC7-nollmusembryon inga uppenbara onormala fenotyper under viloförhållanden. Detta kan förklaras av att PC7-uttrycket i stor utsträckning överlappar furinuttrycket. Många rapporter visar att PC7 och furin bearbetar samma substrat, såsom PDGF-AA, PDGF-BB, vascular endothelial growth factor C och bone morphogenic protein. Alternativt kan det mest bevarade konverteraset PC7 vara involverat i bearbetningen av en panel av icke-essentiella substrat. Noggrann analys av PC7 KO i möss visade dock på beteendeavvikelser relaterade till överskott av dopamin och partiell förlust av proBDNF-aktivering till BDNF i amygdala och hippocampus. Dessa inkluderade förlust av ångest och emotionellt minne, vilket stöder en in vivo roll för PC7 i regleringen av vissa typer av kognitiva prestationer, delvis via pro-BDNF-bearbetning. Human GWAS och biokemiska studier visade att PC7 är en sheddase av den membranbundna transferrinreceptorn till en löslig cirkulerande form, vilket understryker PC7:s roll i järnmetabolismen.

SKI-1/S1P är ett nyckelenzym i regleringen av lipidmetabolismen och kolesterolhomeostasen som klyver transkriptionsfaktorerna sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1 och SREBP-2). De sistnämnda syntetiseras som prekursorer med två transmembran domäner som separeras av en kort ER-luminal slinga och som omfattar N- och C-terminala cytosoliska domäner. Dessa prekursorer klyvs på ett SREBP-klyvningsaktiverande protein (SCAP) och insulininducerad gen (Insig)-beroende sätt. När de cellulära kolesterolnivåerna är höga binder de insulinreglerade proteinerna Insig-1 och/eller Insig-2 SCAP-SREBP-komplexet och behåller det i ER. När cellerna berövas steroler separeras Insigs, vilket gör det möjligt för SREBP-SCAP-komplexet att transportera sig till Golgiapparaten. Där sker en proteolytisk process i två steg som börjar med SKI-1/S1P vid sekvensen R-X-V-L↓ (fig. 2) och sedan site 2-proteas (S2P) frigör de cytosoliska N-terminala segmenten av SREBP från cellmembranen, vilket gör det möjligt för dem att translokeras till kärnan (nSREBP), där de aktiverar transkriptionen av mer än 35 mRNA som kodar för de proteiner/enzymer som krävs för biosyntesen och upptagningen av kolesterol och omättade fettsyror, samt för LDLR-receptorn (low-density lipoprotein receptor).

I likhet med SREBPs spelar den ER-förankrade typ II-membranbundna transkriptionsfaktorn ATF6 en viktig roll i det oveckade proteinsvaret. Under normala förhållanden hålls den i ER av chaperonet BIP, med sin N-terminala DNA-bindande domän mot cytosolen och sin COOH-terminus i ER-lumen. Ackumulering av felaktigt veckade proteiner i ER, som kan induceras av kalciumdepletion (thapsigargin) eller hämning av N-glykosylering (tunicamycin), leder till en ER-stressreaktion som resulterar i att BIP dissocieras från proATF6. Den senare translokeras sedan på ett SCAP-oberoende sätt till Golgi, där den först klyvs av SKI-1 och sedan av S2P. Detta frigör den cytosoliska N-terminala domänen, som når kärnan (nATF6) för att aktivera målgener för ER-stress.

Andra typ II-membranbundna substrat inkluderar minst sex CREB-liknande grundläggande leucinblixtlås transkriptionsfaktorer. SKI-1/S1P SKI-1/S1P har också en kritisk funktion i lysosomernas biogenes, via sin förmåga att aktivera α/β-underenhetens prekursor av GlcNAc-1-fosfotransferas, ett komplex som är kritiskt för sortering av många hydrolaser till lysosomer. BDNF är ett lösligt substrat och studiet av dess bearbetning ledde till den första kloningen av SKI-1. Vi visade också att det lösliga pro-somatostatinet klyvs av SKI-1 för att frigöra den N-terminala peptiden antrin.

De viktiga roller som SKI-1/S1P spelar framgår tydligt av det faktum att deletion av dess gen resulterar i embryonal död i de tidigaste stadierna av celldelningen (dvs. från en- till tvåcellsstadiet), vilket förhindrar blastocystbildning. Med hjälp av vävnadsspecifika knockoutmöss i levern minskade nivån av cirkulerande totalkolesterol med 50 %, vilket understryker dess kritiska kontroll av kolesterolsyntesen och kolesterolupptaget. Att stänga av SKI-1/S1P-uttrycket, särskilt i kondrocyter (3.6 Col1-Cre), resulterade i allvarlig förlamning av nedre extremiteterna, en lockigt förkortad svans och extra ryggkotor i ländryggen. Däremot avslöjades en korsverkan mellan ben och muskler när SKI-1/S1P tystades i osteocyter, eftersom detta resulterade i stimulering av soleusmuskelregeneration och ökad storlek och kontraktila muskelkraft med stigande ålder. Den kritiska betydelsen av detta enzym i det centrala nervsystemet blev uppenbar genom en studie av bearbetningen av den repulsiva vägledningsmolekylen (RGMa) av SKI-1/S1P och furin, vilket avslöjade deras inblandning i axonal tillväxt, och att RGMa-klyvning är nödvändig för neogenin-medierad utväxthämning. SKI-1/S1P-genen (MBTPS1) har inte visat sig vara polymorf och hittills har man inte identifierat någon enskild nukleotid-polymorf variation som skulle kunna vara genetiskt förknippad med en känd patologi, vilket sannolikt understryker behovet av att eliminera mer än 80 % av dess aktivitet innan någon fenotyp ses, och den dödlighet som är förknippad med fullständig förlust av funktionen.