Articles / januari 19, 2022

Frontiers in Physiology

Introduktion

Det mänskliga genomprojektet har förändrat vår förståelse av den grundläggande enheten för genetisk information, där RNA framstår som en mångsidig regulator av centrala cellprocesser (Thum och Condorelli, 2015). De icke-kodande RNA:n (ncRNA), transkript som inte kodar för proteiner utgör den största klassen och delas godtyckligt in i små (<200 nukleotider) och långa icke-kodande RNA:n (lncRNA (>200 nukleotider). MikroRNA (miRNA) är de bäst studerade små ncRNA, som representerar ytterligare ett lager av posttranskriptionella regulatorer som absorberar störningar och säkerställer de biologiska systemens robusthet (Liu och Olson, 2010; Ebert och Sharp, 2012; Rotllan et al., 2016).

En betydande ansträngning har nu riktats mot att dissekera funktionen hos lncRNA. I det kardiovaskulära systemet rapporterades lncRNAs spela nyckelroller i fysiologi och sjukdom och inriktning på lncRNAs för nya terapeutiska interventioner har utforskats (Uchida och Dimmeler, 2015; Boon et al., 2016; Buhrke et al., 2018). Här kommer vi att diskutera de experimentella verktygen för att bestämma RNA-strukturen som kan ge unika insikter i lncRNA-funktionen i det kardiovaskulära systemet.

Utmaningar i bedömningen av lncRNA:s funktionalitet

LncRNA:s unika egenskaper har undersökts omfattande (Guttman och Rinn, 2012; Ulitsky och Bartel, 2013; Bar et al., 2016; Ulitsky, 2016). Flera egenskaper hos lncRNAs gör funktionell utvärdering utmanande. Typiskt sett uppvisar lncRNAs dålig konservering mellan arter som visar endast ”fläckar” av konserverade baser omgivna av stora, till synes obegränsade sekvenser (Ponjavic et al., 2007; Guttman et al., 2009; Necsulea et al., 2014; Washietl et al., 2014). Dessutom uppvisar lncRNAs låg abundans som begränsar deras verkningssätt och verkningsställen (Mercer et al., 2008; Cabili et al., 2011, 2015; Washietl et al., 2014; Ulitsky, 2016; Wilk et al., 2016; Jandura och Krause, 2017). När det gäller funktionssätt har både cis- och trans-regulatorisk aktivitet beskrivits (Mercer och Mattick, 2013). Som cis-regulatorer utövar lncRNAs sin funktion på angränsande gener på samma allel från vilken de transkriberas, och uppvisar uttryckskorrelation och störning på ett allelspecifikt sätt. CARMEN, ett enhancerassocierat lncRNA och en viktig regulator av hjärtspecifikation i mänskliga hjärtprogenitorceller, visades verka i cis för att kontrollera uttrycket av miR-143/145 (Ounzain et al., 2015). Å andra sidan kan lncRNA som agerar i trans styra genuttryck på avstånd från sin transkriptionsplats, genom att förändra kromatintillståndet, påverka kärnstrukturen eller reglera proteinfunktionen (Vance och Ponting, 2014; Kopp och Mendell, 2018).

Intressant nog tycks transkriptionsakten vara viktigare än själva transkriptet för vissa lncRNA som förekommer i låg abundans. I en banbrytande studie manipulerade Engreitz et al. (2016) genetiskt 12 genomiska loci som producerar lncRNAs för att finna att 5 loci påverkade uttrycket av en angränsande gen i cis. Uttrycket av lncRNAs transkriptioner i sig var inte nödvändigt utan istället var processer i samband med deras transkription kritiska (Engreitz et al., 2016).

The RNA Interactome

Ovanstående funktionella mångsidighet hos lncRNAs härstammar från deras förmåga att anpassa sig till olika strukturer och molekylära interaktioner med proteiner, RNA och DNA (Guttman och Rinn, 2012; Marchese et al., 2017). I ribonukleoproteinkomplex (RNPs) kan lncRNAs fungera som ställningar för att stabilisera komplexen och styra dem till specifika subcellulära loci eller DNA. I endotelceller ger interaktion mellan lncRNA MANTIS och ATPasets katalytiska underenheter specificitet till SWI/SNF-komplexet (switch/sucrose non-ferentable) för kromatinremodellering som styr det till en undergrupp av angiogena gener och underlättar nukleosomremodellering och transkriptionsinitiering (Leisegang et al., 2017; Zampetaki och Mayr, 2017). Faktum är att bindning av lncRNA till specifika ATPase-underenheter av SWI/SNF-komplexet är en vanlig regleringsmekanism (Cajigas et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Interaktion mellan lncRNA och kromatinkomplex är särskilt viktig eftersom dessa lncRNA-RNP:er kan utlösa kromatinmodifieringar genom att störa det kromatinmodifierande maskineriet (Tsai et al., 2010; Brockdorff, 2013; Simon et al., 2013). I hjärtat fungerar Chaer, ett lncRNA som är berikat för hjärtat, som en epigenetisk omkopplare genom att störa det polycomb repressiva komplexet 2 (PRC2) och hämma H3K27m3 vid gener som är involverade i hjärthypertrofi (Wang et al, 2016), medan det mesodermt trosbestämmande lncRNA:t Fendrr kan binda till både PRC2- och Trithorax group/MLL-komplexen (TrxG/MLL) och fungera som en finjusterare (Grote et al., 2013).

Avseutom proteiner har lncRNA:s interaktion med DNA också beskrivits. Detta kan leda till bildandet av RNA-DNA triplex, en struktur som är utbredd in vivo och som underlättar lncRNAs erkännande av målgener (Mondal et al., 2015). Denna interaktion demonstrerades elegant i MEG3, ett lncRNA som är berikat för hjärtfibroblaster och som främjar fibros (Piccoli et al., 2017). MEG3 interagerar med PRC2-komplexet och bildar RNA-DNA triplexstrukturer genom GA-rika sekvensbindningsställen. Immunoprecipitering av kromatin-RNA visade att MEG3 modulerar aktiviteten hos TGF-b-vägsgener och att måligenkänning sker via triplexstrukturerna (Mondal et al., 2015).

Långa icke-kodande RNA:s reglerande funktioner är också beroende av RNA-RNA-interaktioner. Crosstalk med miRNA skapar ett intrikat nätverk som utövar posttranskriptionell reglering av genuttryck. LncRNA kan hysa miRNA-bindningsställen och fungera som molekylära lockbete eller svampar som avskiljer miRNA från andra transkript. Det har rapporterats om konkurrens mellan lncRNAs och miRNAs för bindning till mål-mRNAs, vilket leder till de-repression av genuttryck (Yoon et al., 2014; Ballantyne et al., 2016). Slutligen kan lncRNAs innehålla inbäddade miRNA-sekvenser och fungera som en källa till miRNAs (Piccoli et al., 2017).

Länkning av RNA-struktur till funktion

RNA-molekyler antar tertiära interaktioner av högre ordning (Staple och Butcher, 2005; Wan et al., 2011). Även om kopplingar mellan struktur och funktion håller på att växa fram är de strukturella domäner som dominerar RNA-interaktomet fortfarande inte väldefinierade. De funktionella konsekvenserna av transkriptstrukturen förstås bättre vid bearbetningen av primära miRNA (primiRNA) till mogna miRNA. Med hjälp av flera mutagenesetester definierades de sekundära strukturerna såsom stamlängd, hårnålsparning, utbuktningsstorlek och -position samt storlek på den apikala slingan som bidrar till en effektiv miRNA-biogenes (Auyeung et al., 2013; Fang och Bartel, 2015; Nguyen et al., 2015; Roden et al., 2017). I klustrade miRNA som består av flera miRNA-gener föreslogs också att den tertiära strukturen bidrar till bearbetningen till enskilda mogna miRNA. En autoreglerande roll för den tertiära strukturen hos miR-17∼92-klustret i dess mognad och bindning av hjälpfaktorer till konserverade terminala slingor visades (Chakraborty et al., 2012). Nyligen rapporterades i klustret miR-497∼195 mutationer i miR-195a hårnålen påverka bearbetningen av miR-497a som befinner sig i samma kluster. Beräkningsanalyser lyfte fram skillnader i primiRNA:s tertiärstruktur i mutanter som kan påverka mognadsprocessen (Lataniotis et al., 2017). På ett annat sätt främjar tertiärstrukturen i primiR-30c-1 interaktionen med SRSF3, en medlem av SR-proteinfamiljen som underlättar erkännande och bearbetning av primiRNA. En enda G/A-sekvensvariation leder till en strukturell omläggning av primiRNA:s apikala region som påverkar de konserverade resterna som är placerade i den basala delen av stam- och mogna miRNA-generationen (Fernandez et al, 2017).

I lncRNAs kan selektion som verkar på struktur snarare än primärsekvens förklara den snabba utvecklingstakten, som ledde till hypotesen om ”RNA modular code” som bygger på uppfattningen att selektion verkar på strukturella domäner (Wutz et al., 2002; Tsai et al., 2010; Guttman och Rinn, 2012). Vissa experimentella bevis stöder detta koncept. MEG3 lncRNA-genen innehåller tre distinkta strukturmoduler M1, M2 och M3. Deletionsanalyser visade att motiven M2 och M3 är viktiga för p53-aktivering. Intressant nog var ett hybrid MEG3-transkript där hälften av den primära sekvensen i M2-motivet ersattes av en helt orelaterad artificiell sekvens som uppvisade en liknande sekundärstruktur fullt funktionell när det gällde att stimulera p53-medierad transkription (Zhang et al., 2010).

Metoder för bestämning av RNA:s struktur

Kemiska och enzymatiska provtagningsmetoder kan ge en förståelse för RNA:s sekundärstruktur (Ehresmann et al., 1987). Enzymatisk sondering bygger på nukleaser som binder till parat och oparat RNA och smälter det för att generera RNA-fragment som kan analyseras. Vid kemisk sondering används däremot kemikalier av liten storlek som reagerar och kovalent modifierar nukleotider som är tillgängliga för lösningsmedel. Efter modifiering eller klyvning kartläggs positionerna vanligtvis genom omvänd transkription, som antingen stoppar eller introducerar en mutation i cDNA (Wilkinson et al., 2006). En analys av det resulterande cDNA:t används sedan för att bestämma nukleotidpositionen och modifieringsfrekvensen. Nästa generations sekvensering (NGS) kan tillämpas för att direkt sekvensera cDNA-produkterna. Detta gör det möjligt att karakterisera RNA-strukturen på transkriptomövergripande nivå i ett enda experiment (Lucks et al., 2011; Incarnato et al., 2014; Loughrey et al., 2014; Rouskin et al., 2014). Även om tekniken ursprungligen etablerades för att analysera RNA-strukturen in vitro, har strukturell karakterisering in vivo främst genom användning av prober som snabbt kan diffundera genom membraner också rapporterats (Spitale et al., 2013; Ding et al., 2014; Spitale et al., 2015; Flynn et al, 2016).

Enzymatic Probing

PARS

PARS (parallell analys av RNA-struktur) är en enzymatisk sonderingsmetod med högt genomflöde som mäter de strukturella egenskaperna hos isolerade polyadenylerade transkriptpooler som renatureras in vitro och behandlas med RNase V1 eller S1. RNas V1 och RNas S1 klyver 3′-fosfodiesterbindningarna hos dubbelsträngat respektive enkelsträngat RNA, vilket gör det möjligt att utvärdera den dubbel- eller enkelsträngade konformationen (Kertesz et al., 2010).

Frag-Seq

Frag-Seq (fragmentationssekvensering) är en enzymatisk metod som använder ett nukleas P1 för att specifikt klyva enkelsträngat RNA. Genom sekvensering med hög kapacitet analyseras sedan de fragment som genereras. Detta arbetsflöde ger en ”RNA-tillgänglighetsprofil” som liknas vid DNase hypersensitivity assays på kromatin (Underwood et al., 2010). Noterbart är att Frag-seq isolerar fragment <200 baser efter RNase P1-klyvning, varför stora RNA kanske är underrepresenterade. Eftersom Frag-seq och PARS kan ge kompletterande data kan ett kombinerat tillvägagångssätt förbättra noggrannheten i mätningar av RNA-strukturer över hela genomet (Wan et al, 2011).

Kemisk probning

DMS-probning

Dimetylsulfat (DMS) är ett basspecifikt reagens som kan binda och förändra metyleringstillståndet hos oparade adenosin- och cytosin-nukleotider (Tijerina et al., 2007; Rouskin et al., 2014). DMS footprinting är optimerad för strukturell analys av RNA. Proteinbindning till RNA genererar ett ”fotavtryck” som kan spåras på grund av förändringar i RNA-strukturen. Transkriptstorleken som kan utvärderas är ganska liten (<500 nt) men denna metod kan utföras både in vitro och in vivo eftersom DMS lätt kan tränga igenom cellmembranet. DMS-seq som kombinerar DMS-metylering med NGS utfördes nyligen in vivo (Ding et al., 2014; Rouskin et al., 2014).

Targeted Structure-Seq

Targeted Structure-Seq bygger på att RNA-metylering genom DMS utförs in vivo. Därefter isoleras RNA från cellerna och metyleringsställena bestäms genom att använda genspecifika primers för den omvända transkriptionsreaktionen. Sekvensering av de fragment som härrör från DMS kan användas för att bedöma RNA:s cellulära konformation. Baserat på denna metod utvecklades strukturella modeller av element inom Xist (Fang et al., 2015). Även om detta arbetsflöde ursprungligen rapporterades med hjälp av DMS kan det anpassas till andra sonderingsreagenser.

SHAPE

SHAPE (selektiv 2′-hydroxylacylering genom primerförlängning) kan förhöra RNA:s struktur både in vitro och in vivo med hjälp av kemikalien NMIA och dess derivat för att detektera flexibla regioner i RNA:s sekundärstruktur (Wilkinson et al., 2006; Weeks och Mauger, 2011). Flera SHAPE-reagenser har testats för att förbättra förhållandet mellan signal och bakgrund (Lee et al., 2017). I SHAPE acyleras 2′-hydroxylgrupperna för alla fyra nukleotider selektivt när de är flexibla och oparade. Detta resulterar i bildandet av kovalenta SHAPE-addukter som blockerar den omvända transkriptionen vilket leder till trunkerade cDNA-fragment. SHAPE-reaktiviteten kan sedan användas för att modellera sekundärstrukturer och kvantifiera alla processer som modulerar RNA-dynamiken.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP (SHAPE and mutational profiling) var den första som kombinerade SHAPE-protokollet med NGS. SHAPE-MaP, som ursprungligen utfördes och rapporterades för att definiera HIV-1 RNA-genomet, är en mycket känslig teknik som möjliggjorde snabb, de novo-upptäckt och direkt validering av nya funktionella motiv (Siegfried et al., 2014; Mustoe et al, 2018).

In-cell SHAPE-Seq

In-cell SHAPE-Seq är en modifiering av SHAPE-Seq-tekniken som kombinerar SHAPE-seq med mätningar av genuttryck för att belysa sambandet mellan RNA-struktur och funktion in vivo. Den avslöjade translationella regleringsmekanismer i E. coli in vivo (Watters et al., 2016).

icSHAPE-seq

icSHAPE-seq (in vivo click SHAPE-sekvensering) använder in-cell SHAPE-kemikalie NAI-N3 följt av selektiv kemisk anrikning av NAI-N3-modifierat RNA som ger ett förbättrat signal-till-brus-förhållande (Flynn et al., 2016). Uppföljande NGS möjliggör noggrann identifiering med upplösning på en enskild nukleotid. I embryonala stamceller från mus har det visats att RNA-veckning in vitro programmeras helt och hållet av sekvensen, medan RNA-strukturen in vivo beror på kontexten av den intracellulära miljön och interaktionen med RNA-bindande proteiner som kan leda till fokala strukturella omarrangemang (Spitale et al., 2015). Därför erbjuder denna analys en spännande möjlighet att se RNA-strukturomen in vivo i närvaro eller frånvaro av stimulering.

RNA Structurome and Interactome Determination

PARIS

PARIS (psoralen analysis of RNA interactions and structures) har nyligen utvecklats för att bestämma både RNA-struktur och interaktioner in vivo. Den använder det mycket specifika och reversibla korsbindningsmedlet psoralenderivat 4′-aminometyltrioxsalen för att fixera baspar i levande celler. Därefter leder partiell RNas- och fullständig proteinasspjälkning till rening av en uppsättning små korsbundna och direkt basparade RNA-fragment. Rening av de tvärbundna fragmenten med hjälp av 2D-elektrofores, följt av närliggande ligering av duplexa RNA-fragment, omvändning av tvärbindningar och sekvensering med hög kapacitet avslöjar den direkta basparningen mellan fragmenten. Baserat på dessa läsningar kan modeller av RNA-strukturer och interaktioner genereras med hög specificitet och känslighet (Lu et al., 2016). Med hjälp av detta tillvägagångssätt förhördes en modell för Xists struktur av högre ordning (Lu et al., 2016). Uppmuntrande nog stämmer dessa resultat överens med kristallografiska studier av de definierade domänerna in vitro (Arieti et al., 2014).

lncRNA Structure Determination

Strukturbestämning av lncRNA in vivo är extremt utmanande eftersom de är mycket heterogena med regioner med väldefinierad basparning, andra utan basparning och regioner med flera strukturer. Dessutom kan lncRNAs sträcka sig över tusentals nukleotider, de uttrycks i låg abundans och tenderar att vara en del av multikomponentkomplex (Busan och Weeks, 2017). Trots detta har strukturen hos flera lncRNAs bestämts experimentellt (tabell 1).

TABELL 1

TABELL 1. Strukturell bestämning av lncRNAs.

Xist

Detta är ett mycket långt lncRNA (17 000 nukleotider) som kontrollerar X-kromosoms inaktivering. Det sprids över hela kromosomen samtidigt som det utlöser stabila epigenetiska modifieringar genom rekrytering av PRC2-komplexet och anrikning för den repressiva kromatinmodifieringen H3K27me3 (Simon et al., 2013; Fang et al., 2015; Smola et al., 2016). In vivo SHAPE-data identifierade 33 regioner i Xist som bildar väldefinierade sekundärstrukturer kopplade till strukturellt variabla och dynamiska regioner.

RepA

Detta är ett 1 600 nukleotider långt lncRNA från mus som kodas av en intern promotor på Xist-genets sense-sträng. Genom att tillämpa SHAPE- och DMS-kemisk sondering in vitro avslöjades en intrikat struktur av tre oberoende vikningsmoduler. Fylogenetisk analys och beräkningsmässig 3D-modellering visade på en definierad tertiär arkitektur som kan bildas autonomt i avsaknad av proteinpartners (Liu et al., 2017a).

Rox1/Rox2

I Drosophila uppnås doseringskompensation med hjälp av två lncRNA som transkriberas från X-kromosomen. RNA på X 1 och 2 (roX1 och roX2) är 3 700 respektive 1 200 nukleotider långa. SHAPE-sondering in vitro och PARS-analys avslöjade gemensamma, bevarade och distinkta strukturella motiv som kan fungera som målpunkter och samlingsplattformar för det manliga specifika dödliga komplexet (Ilik et al., 2013).

SRA

Den humana steroidreceptor-RNA-aktivatorn (SRA) är ett lncRNA med 870 nukleotider som härstammar från en gen som kodar för både lncRNA- och proteinkodande transkriptioner. SRA:s struktur undersöktes experimentellt med hjälp av SHAPE- och DMS-kemisk sondering in vitro. Parallellt med detta utfördes en enzymatisk provning med RNase V1. Det visades att SRA består av fyra olika domäner med olika sekundärstrukturer (Novikova et al., 2012). Ännu viktigare är att en jämförande strukturanalys mellan mus och människa starkt tyder på att ett stort antal evolutionära förändringar hade minimal mutationseffekt på proteinet som härstammar från lokus samtidigt som RNA-strukturkärnan stabiliserades (Novikova et al, 2012).

HOTAIR

Associerat med Sporadic Thoracic Aortic Aneurysm genom reglering av extracellulär matrisdeposition och apoptos av humana aortiska glatta muskelceller, spelar detta lncRNA en nyckelroll i det kardiovaskulära systemet (Guo et al., 2017). Hos patienter med hjärtsvikt som inte befinner sig i slutskedet var HOTAIR bland en panel av lncRNA som var signifikant modulerade (Greco et al., 2016). En skyddande roll för HOTAIR i kardiomyocyter (Gao et al., 2017) och som en cirkulerande biomarkör för akut hjärtinfarkt och medfödda hjärtsjukdomar föreslogs också (Jiang et al., 2018). Hotair är 2 148 nukleotider lång vilket gör strukturbestämningen extremt utmanande. För att lösa detta problem upprättades ett icke denaturerande reningsprotokoll för att erhålla en homogen och monodisperse form. Strukturella moduler och distinkta evolutionärt bevarade element bestämdes in vitro med hjälp av kemisk sondering med SHAPE- och DMS-reagens (Somarowthu et al., 2015).

Braveheart

Braveheart är ett lncRNA med 590 nukleotider som agerar i trans för att reglera kardiovaskulärt linjeband. Dess sekundärstruktur bedömdes experimentellt med hjälp av SHAPE- och DMS-sondering in vitro. Det visade sig att Braveheart är organiserad i en mycket invecklad modulär struktur som består av tre domäner, bestående av 12 spiraler, 8 terminala slingor, 5 stora interna slingor och en femvägskoppling. Intressant nog innehåller den en 5′ asymmetrisk G-rik intern slinga (AGIL) och en 55 nukleotidsträcka i 3′-änden som uppvisar hög reaktivitet, vilket tyder på låg sannolikhet för att den är strukturerad. Genetisk deletion av detta specifika 11-nukleotidfragment visade att AGIL-motivet är väsentligt för differentiering av embryonala stamceller från mus till kardiomyocyter genom bindning av zingfingerproteinet CNBP/ZNF9 (Xue et al., 2016).

Framtida riktningar

Detektering av RNA-struktur i kombination med genetiska manipuleringar kan belysa viktiga funktionella domäner hos lncRNA:er. I detta syfte bör avancerade experimentella verktyg, bioinformatik och genomteknik integreras. CRISPR/Cas9-systemet för genredigering har visat sig vara en robust teknik som kan användas för att generera riktade ändringar vid exakta genomiska loci. Cas9, som är ett nukleas som kan orsaka dubbelsträngade brott (DSB) i DNA, kan styras i omedelbar närhet av det prototillhörande motivet NGG av en RNA-molekyl (sgRNA) som består av en liten 20 nukleotidlång variabel sekvens och ett adaptor transaktiverande RNA. Exakta insättningar, borttagningar eller bassubstitutioner kan införas på en DSB-plats (Lin et al., 2014) i primära celler och in vivo i musmodeller av sjukdomar (Platt et al., 2014; Abrahimi et al., 2015). En modifierad version av CRISPR/Cas9-systemet har nyligen använts för screening av funktionella lncRNA i genomskala. Denna CRISPR-interferensmetod använder ett nukleasdött Cas9 (dCas9) som inte kan inducera DSB på DNA. Fusionerad med en repressordomän (t.ex. KRAB) (Liu et al., 2017b) eller en aktiveringsdomän (t.ex. VP64) (Konermann et al., 2015; Bester et al., 2018) dCas9 och kan styras av sgRNAs till specifika loci i den regulatoriska regionen uppströms för att utlösa repression respektive aktivering av lncRNA-transkription. Sådana metoder är ytterst användbara för att testa funktionaliteten hos lncRNAs på ett sätt med hög genomströmning.

När specifika lncRNAs har identifierats är tekniker som kan definiera lncRNA-strukturen in vivo kritiska för att bestämma lncRNA-moduler och strukturella domäner. Bestämning av RNA-strukturen kan kopplas till komparativ genomisk analys som tar hänsyn till positionskonservering och det faktum att lncRNAs kan förlita sig på korta element snarare än långa sträckor av konserverade sekvenser. Genetiska studier som kan rikta in sig på just dessa strukturella domäner samtidigt som lncRNA:s uttryck bibehålls (Matsumoto et al., 2017) kommer att beskriva den funktionella effekten av dessa motiv. Användningen av CRISPR/Cas9-genredigering i inducerade pluripotenta stamceller som kan expanderas klonalt, konstrueras för att hysa definierade deletioner av de strukturella motiven och differentieras till andra celltyper (Cochrane et al., 2017; Granata et al., 2017) kan ge slutgiltiga bevis för den funktionella påverkan av dessa domäner i det kardiovaskulära systemet. Potentialen hos dessa element som nya mål kan utforskas ytterligare för exakta interventioner som lämpar sig för terapeutiska tillämpningar.

Författarens bidrag

AZ initierade studien, utformade dess struktur och skrev manuskriptet. AA gav konceptuella råd och reviderade manuskriptet. KS utformade granskningsstrukturen, gav konceptuella råd och reviderade manuskriptet. Alla författare läste och godkände den inlämnade versionen.

Finansiering

Detta arbete finansierades av British Heart Foundation. AZ är Intermediate Fellow i British Heart Foundation (FS/13/18/30207).

Intressekonfliktförklaring

Författarna förklarar att forskningen utfördes i avsaknad av kommersiella eller ekonomiska relationer som skulle kunna tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Abrahimi, P., Chang, W. G., Kluger, M. S., Qyang, Y., Tellides, G., Saltzman, W. M., et al. (2015). Effektivt genavbrott i odlade primära mänskliga endotelceller från människa med CRISPR/Cas9. Circ. Res. 117, 121-128. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.306290