F-actin

Kristallstruktur av F-actin, 2zwh

Filamentous actin (F-actin)-enheter kallas också för mikrofilament och är mycket bevarade proteinkomponenter som finns nästan ubiquit i eukaryota cytoskelett. F-aktin och andra aktinproteiner har i allmänhet strukturella roller i celler.

Introduktion

Aktin finns i nästan alla eukaryota celler och är främst känt för sin funktion som struktur- och translokationsprotein. Det har också en ATPasfunktion, eftersom det hydrolyserar ATP till ADP och Pi och genomgår konformationsförändringar vid varje hydrolys. Actin tillhör actin superfamiljen, som inkluderar andra proteiner som Hsp70(DnaK), Hsc70 och hexokinas, på grund av sin nukleotidberoende konformationsförändring. På grund av den likhet som observerats hos Escherichia Coli, Hsc70 och aktins ATPasedomän tros det att de två proteinerna har ett gemensamt ursprung. Prokaryoter är inte kända för att ha aktin, men har dock en aktinhomolog, MreB, vilket också leder till tanken på en möjlig gemensam härstamning.

Aktin förekommer i två former: globulärt aktin (G-aktin), de fria monomera enheterna av aktin, och filamentärt aktin (F-aktin) som är polymerformen. Dessa två former existerar i en dynamisk jämvikt med varandra då ATP-associerad polymerisering och depolymerisering sker kontinuerligt i cellen. Monomerenheterna i F-actin har en form som skiljer sig från den fria monomera formen och det är ett resultat av denna förändring som den mer specifika ATPasaktiviteten kan observeras.

Assembly

(1J6Z).

G-actin är den fria monomera formen av aktin som polymeriseras till F-actin. Strukturerna hos globulärt och filamentärt aktin skiljer sig från varandra på många sätt, trots att G-aktin består av F-aktin. När det monomera aktinet polymeriseras till F-aktin blir enheten tillplattad. Dessutom har F-actin en ATPasfunktion som är minimal i G-actin. Domänerna och den aktiva platsen är desamma när det gäller ingående komponenter och kommer senare att diskuteras när det gäller F-actin-monomeren.

G-actin verkar ha fler ligander i sin struktur, utanför den aktiva platsen. Endast 3 av de 5 tros faktiskt existera i lösning och tros bidra till polymeriseringen av G-actin till F-actin. Denna representation av G-actin har också en som observeras i vissa kristallina aktinstrukturer men inte nödvändigtvis. Den observerade molekylen på Cys374, användes för att blockera polymerisationsaktiviteten så att kristallen av G-actin kunde observeras

Formationen av F-actin är en dynamisk process av sammansättning och nedmontering som har benämnts ”trampning”. Övergången mellan G- och F-actin börjar med en stabiliserad oligomer av ATP-actinenheter som bildas genom ett veckningsmönster av nukleation-kondensationstyp. Därefter sker tillsättning av ATP-monomeriska enheter till båda ändarna, men på grund av en skillnad i laddningspolaritet i de två ändarna sker en preferentiell tillsättning till vad som kallas ”plusändan (+)” eller ”taggändan”. I den motsatta änden, ”minus (-) änden” eller ”den spetsiga änden”, sker en preferentiell dissociering av aktinenheter.

När det ATP-bundna aktinet har fästs sker en hydrolys av ATP som ger det ADP- och Pi-bundna tillståndet. Efterföljande förlust av ett Pi lämnar ADP-aktintillståndet. På grund av möjligheten att lägga till eller ta bort monomera enheter i båda ändar kan sammansättningen av F-actin beskrivas i termer av jämvikt. Eftersom hastigheten för ATP-aktinassocieringen är tio gånger högre än hastigheten för ADP-aktin-dissocieringen ser F-aktin ut att röra sig framåt, eller ”trampdrift”. ADP-actin-monomerer dissocieras vid minusändan och återvinns till ATP-actin så att polymerisering vid plusändan kan ske igen.

Struktur

Strukturens historia

F-actinproteinet upptäcktes av Straub 1942. Strukturen spekulerades utifrån en röntgenkristallografi med låg upplösning som hittades 1990 av Holmes et al. och under denna tid accepterades ”Holmes-modellen”. Däremot har G-actinstrukturen bestämts oberoende av varandra över 30 gånger. En F-actinmodell med högre upplösning deponerades först nyligen i PDB-databanken i december 2008 av Oda et al. .

F-actin Monomer och polymer

(2zwh)

Monomer

Varje F-actinmonomer har, som en del av sin tertiärstruktur, flera slingor som är viktiga för att den ska kunna sättas samman till det polymera F-actinet. Dessa slingor genomgår konformationsförändringar beroende på tillståndet hos den bundna nukleoiden eller så tjänar de som regioner för intilliggande monomera aktinenheter att binda till. Den fungerar som en ”omkopplare” för konformationer, baserat på den bundna nukleotiden. De DNAse I-bindande loopresterna (40-50) genomgår konformationsförändringar som påverkar stabiliteten och binder DNAse I-enzymer och antas hålla DNAse I kvar. Den hydrofoba slingan, som sträcker sig över resterna 264-273, och slingan , som sträcker sig över resterna 165-172, fungerar som platser där intilliggande D-slingor av monomerer av aktin kan binda till. En liknande funktion noteras för resterna (374-375).

F-actinmolekylen som visas här består av 375 rester(43kDa) och två ligander, ADP och Ca2+. Den har två huvuddomäner som är åtskilda av en nukleotidbindande klyfta. Beroende på tillståndet hos den bundna nukleoiden ändras F-actins mest stabila konformation. I sina ATP- och ADP + Pi-nukleotidbundna tillstånd har den en stängd bindningsklyfta. I dess endast ADP-bundna tillstånd har den en bredare bindningsklyftaEtt karakteristiskt drag hos aktin är att domänerna förblir vridna i förhållande till varandra, trots de nukleotidstatusberoende konformationsförändringarna.

F-aktinpolymer (baserat på Ken Holmes F-aktinstruktur)

Polymer

F-aktin har utseendet av två högerhänta helikser med en gradvis vridning runt varandra. Den består i själva verket av upprepningar av 13 aktinenheter för varje 6 vänstersvängar, som sträcker sig över en längd av 350 Å.

Nukleotidstatusberoende konformationsförändringar

Statusen för den bundna fosforylerade nukleoiden påverkar vilken konformation F-actin-monomern företar. Närvaron av en gammafosfat i den aktiva platsen orsakar rotation av en Ser14 rest. Denna förändring leder till att en metylerad histidin (HIC73) blir förskjuten, vilket förändrar F-actins aktiva plats och orsakar en konformationsförändring i D-slingan. HIC73 är placerad i ”sensorslingan”, eller ”switchen” för att koppla förändringar i bunden nukleotid till konformationsförändringar. I ATP-actin och ADP-Pi-actin är D-slingan ostrukturerad. I den ADP-bundna formen av F-actin är en alfahelix vanligt förekommande i monomerns D-slinga.

Och även om alfa-helixen inte observeras i denna Oda-modell av F-actin och inte heller i vissa andra F-actin-studier, erkänner Oda et. al att de experimentella resultaten skulle kunna ha lett till en förlängd alfa-helix i modellen, i motsats till en förlängd oordnad sträng som det interagerande segmentet mellan F-actin-monomeriska enheter.

Domäner

(2zwh)

Strukturen av en enskild enhet av F-actin härrör från en polypeptidkedja med två domäner. Den nukleotidbindande klyftan, platsen för ATP-hydrolys, kan observeras mellan de två domänerna. Domänernas rörelse gör det möjligt att skapa öppna och slutna F-actin-konformationer.

Domänernas rörelse möjliggörs genom rotation kring , som visas i lila. Enligt Oda et al. tros domän 2 under övergången från G- till F-aktin luta 20° och passa ihop med domän 1, vilket ger en plattare konformation än det fria G-aktinet. Det är inte säkert om denna tillplattning sker före eller efter ATP-hydrolys. Holmes ger en förenklad bild av denna domänrörelse och tillplattning.

Stabilitet

Den tillplattade veckade formen av F-actin kräver andra stabiliseringsmekanismer än den fria monomera G-actinformen. Stabiliteten hos F-actinkomplexet uppnås genom en serie som innefattar arginin 206, 183, 177 (lila); glutamat 72(blå), aspartat 187(grön), 179 och 4-metylhistidin 73(gul). Ytterligare stabilitet tros uppstå från ett avbrott i interaktionen mellan rester i samma halva av sina respektive domäner till en ny interaktion mellan där ett mycket större avstånd observeras mellan dem.

När Pi frigörs resulterar en konformationsförändring på D-slingan i att F-actinfilamentet ”mjukgörs”. Det vill säga, den gör ADP-actin-monomeren mer instabil och gör den mer mottaglig för klyvning

Active Site

När aktin binds på plusändan av aktinfilamentet aktiveras ATPase-funktionen. Konformationsförändringen från G- till F-aktin främjar den katalytiska aktiviteten på grund av den 20°-förskjutning som leder till en mer sluten bindningsplats; denna konformationsförändring stabiliseras också av den diagonala subdomäninteraktionen mellan Leu110 och Thr194. Som ett resultat av dessa konformationsförändringar flyttas aktin närmare ATP-Ca2+-liganden. Gln137 håller en vattenmolekyl, och genom att placera den i närheten av ATP möjliggörs en klyvning av gammafosfatet. Frigörandet av den oorganiska fosfaten sker via konformationsförändringen av den flexibla ”D-slingan” till en ordnad alfa-helix (dock inte demonstrerad av denna modell).

Funktion

F-actin utför en strukturell, mekanisk och enzymatisk roll inom eukaryota celler. Dessa funktioner utesluter inte nödvändigtvis varandra.

F-actins dynamiska funktioner är starkt involverade i cellmigrationen.

Cytoskelett

F-actin är den mest förekommande komponenten i eukaryoternas cytoskelett. Den ger stora mängder dragkraft med tanke på sin tunna storlek. I fall där flexibiliteten inte är önskvärd som strukturell komponent kan tvärbindningar bildas mellan F-actinpolymerer för att ge större styvhet och stöd.

Förlängning av F-actinförgreningar leder till fenomenet att plasmamembranet skjuts framåt vid lamellopodial och filopodial förlängning. Denna process är beroende av det dynamiska jämviktstillstånd i vilket G- och F-actin existerar, eftersom det är den kontinuerliga polymeriseringen av aktinenheter på den främre kanten som driver fram membranutvidgningen. Utan F-actins enzymatiska ATPasfunktion skulle denna process inte vara möjlig.

Actin-Myosin

F-actins relativt plattare form jämfört med G-actins gör att myosin företrädesvis kan binda F-actin framför G-actin. Detta innebär att F-actin, inte G-actin, är den funktionella formen av aktin. Den utgör en stor del av de tunna filamenten tillsammans med myoin för att ge muskelkontraktioner. F-actins struktur ger det ett stort motstånd mot omfattande krafter, t.ex. de som upplevs vid muskelkontraktion.