EzColocalization: En ImageJ-plugin för visualisering och mätning av kolokalisering i celler och organismer

Översikt över EzColocalization-arbetsflödet

Arbetsflödet för EzColocalization är uppdelat i fyra moduler, var och en med en egen flik i GUI. Flikarna är: (i) ”Inputs” där bilder, masker eller listor över regioner av intresse (ROI) väljs och anpassas, (ii) ”Cell Filters” där celler kan väljas utifrån fysiska egenskaper och signalintensitet, (iii) ”Visualization” där värmekartor, scatterplots och metriska matriser (definierade nedan) skapas och (iv) ”Analysis” där kolokaliseringsmått och utdata väljs. Alla moduler och alla processer inom en modul behöver inte användas. Vissa flikar har en ”Preview”-knapp för att köra en specifik modul i stället för ”Analyze”-knappen som kör alla valda processer i alla moduler.

Inputs

Bildfiler, som väljs i fliken ”Inputs” (fig. 1A), måste vara: (i) monokromatiska (dvs. inte RGB- eller CMYK-format), (ii) 8-bitars, 16-bitars eller 32-bitars, och (iii) i ett format som TIFF som behåller de ursprungliga pixelintensitetsvärdena. Stora bilder kan komprimeras för filöverföring med hjälp av ett förlustfritt format som ZIP eller LZW, och sedan dekomprimeras för analyser. Förutom bilder kan EzColocalization acceptera masker och ROI-listor för cellidentifiering (se nedan). Om det finns flera bilder för varje kanal bör bilderna staplas för effektivare analys i menyn ”Stack” (se ImageJ-guiden för mer information24). Bilderna i en stapel kan vara olika synfält eller en tidsserie, men måste ha samma dimensioner, förstoring och bildordning för varje kanal. Fliken inmatning ger också alternativ för att ställa in tröskelvärden för signalintensitet och för att anpassa feljusterade bilder från olika kanaler (fig. 1B och kompletterande information). Rekommendationer för att skaffa lämpliga bilder för kolokaliseringsanalys finns i den kompletterande informationen. Observera: Justeringen fungerar utifrån antagandet att ett lämpligt tröskelvärde för signalintensitet kan väljas för att skilja pixlar inom och utanför cellerna; om tröskelvärdet omfattar områden utanför cellen eller endast ett begränsat område inom cellerna kan det hända att justeringen inte fungerar som den ska. Av denna anledning bör alla anpassningar kontrolleras visuellt genom att undersöka ROIs för att bekräfta att lämpliga cellområden är valda.

EzColocalization är i första hand utformad för en ”cellidentifierings”-kanal och två eller tre ”reporter”-kanalbilder. Den kan dock fungera med andra inmatningskombinationer (tabell S1). Cellidentifieringskanalen används för att identifiera enskilda celler och följaktligen för att särskilja intracellulära och extracellulära pixlar. Cellidentifieringskanalen kan vara vilken typ av bild som helst som gör det möjligt att identifiera cellgränserna, inklusive: ljusmikroskopiska bilder (t.ex. faskontrast25,26 och ljusfält), bilder med en reporter som markerar cellmembranet eller som finns i hela cytoplasman (t.ex. Cy5, fig. 1B) och bilder med ett extracellulärt färgämne som avgränsar cellerna. DIC-bilder (Differential Interference Contrast) skapar skuggor som gör det svårt att automatiskt välja ut celler med hjälp av tröskelmetoder27 . För DIC-bilder rekommenderar vi därför att ROI:er skapas med hjälp av ”urvalsverktygen” i ImageJ för att manuellt avgränsa cellområden och sedan lägga till dem i en lista genom att välja ”Add to Manager” (i ”Selection”-undermenyn i ”Edit”-menyn). När ROIs för alla intressanta celler i en bild har valts ut kan en binär mask skapas med hjälp av funktionerna ”Clear Outside” och ”Autothreshold” i ImageJ.

Cell Filters

Fliken ”Cell Filters” används för att hjälpa till att välja ut celler i bilder (Fig. 2A) och särskilja intracellulära och extracellulära pixlar. Celler identifieras genom: (i) välja en av ImageJ:s tröskelalgoritmer24 eller välja trösklarna manuellt (vilket görs genom att välja ”*Manual*” från en rullgardinslista i fliken Inputs och trycka på knappen ”Show threshold(s)”), för att identifiera regioner som motsvarar celler i cellidentifieringskanalen (Fig. 2B), ii) användning av vattendelare för att separera rörliga objekt i bilderna från cellidentifieringskanalen (valfritt) (fig. 2B), iii) val av objekt från bilderna från cellidentifieringskanalen baserat på fysiska parametrar (fig. 2C) och signalintensitet (fig. 2D). EzColocalization kommer att försöka att automatiskt upptäcka om inmatningsbilderna har mörk eller ljus bakgrund med hjälp av skewness. Om man antar att det finns fler pixlar i bakgrunden än i cellerna, indikerar en bild med positiv skewness en mörk bakgrund och negativ skewness en ljus bakgrund. Användarna kan också manuellt välja om inmatningsbilderna har mörk eller ljus bakgrund i alternativen ”Parametrar…” i menyn ”Inställningar”. Celler som bara delvis finns i en bild, och därför skulle kunna ge missvisande värden, tas automatiskt bort från analyserna.

EzColocalization har ett valfritt ”Pre-watershed filter” och åtta valfria post-watershed filter (med möjlighet att välja fler). Watershed-segmentering kan hjälpa till att separera delande och rörliga celler28 men den kan också dela upp stora objekt som aggregat av extracellulärt material i mindre fragment som är lika stora som celler. För att undvika det sistnämnda kan filtret Pre-watershed användas för att utesluta objekt med stora områden från analysen. Med knappen Förhandsgranskning på fliken Cellfilter kan användaren se vilka objekt på den aktuella bilden som kommer att väljas när minimi- och maximigränserna för alla filter justeras. Det finns två klasser av parametrar för cellfiltren efter vattendelare (tabell S2): (i) fysiska parametrar baserade på mätningar från cellidentifieringskanalen, och (ii) signalintensitetsparametrar från reporterkanalerna. Fysiska parametrar gäller för alla kanaler medan signalintensitetsparametrar endast gäller för den rapportörkanal för vilken de har valts (eftersom rapportörerna kan ha mycket olika signalnivåer). Förutom filtrering baserad på fördefinierade alternativ i ImageJ har EzColocalization filter för ”MeanBgndRatio” eller ”MedianBgndRatio”, som beräknas genom att dividera medelvärdet eller medianen av signalintensiteten för pixlar inuti ett objekt med respektive medelvärde eller medianvärde av signalintensiteten för extracellulära pixlar.

Visualisering

Fliken ”Visualisering” visar signaler eller mätvärden i celler som: (I) ”värmekartor”, (ii) spridningsdiagram och (iii) ”metriska matriser” (Fig. 3A).

Värmekartor är pseudofärgbilder som visar den relativa storleken på signaler från rapportörer (Fig. 3B). De genereras genom normalisering och omskalning så att de lägsta och högsta pixelvärdena är 0 respektive 255 i varje cell, bild eller stapel. Det finns åtta alternativ för färgning av värmekartorna, och intensitetsvärdena för varje färg erhålls från funktionen ”Show LUT” (inom undermenyn ”Color” i menyn ”Image” i ImageJ). Cellvärmekartor lämpar sig för att bestämma var varje reporter förekommer med högst intensitet i cellerna. Bildvärmekartor kan visa om olika celler inom ett synfält har väsentligt olika intensitet, vilket kan tyda på biologisk heterogenitet eller ojämnheter i märkningen. Stapelvärmekartor kan visa om celler i olika bilder har väsentligt olika nivåer av signalintensitet, vilket kan tyda på ojämnheter i märkning eller mätningar över ett objektglas (t.ex. på grund av fotoblekning) eller förändringar i signalen över tiden (om stapeln är en tidsserie). Observera: värmekartans utseende påverkas av inställningar för ljusstyrka och kontrast.

Scatterplots visar förhållandet mellan signalintensiteten för två eller tre reporterkanaler för enskilda celler och bilder (fig. 3C). Detta förhållande är viktigt för att välja lämplig kolokaliseringsmätning (kompletterande information). Scatterplots kan också avslöja heterogenitet i lokaliseringsmönstren8, vilket kan kräva borttagning av bakgrundspixlar eller separata analyser för olika celltyper.

Metriska matriser ger en översikt över lokaliseringsmönster genom att visa de beräknade värdena för en kolokaliseringsmetrik för många tröskelkombinationer. Metriska matriser för tröskelöverlappningsresultatet (TOS) har visat sig vara användbara för analys av lokaliseringsmönster för två reporterkanaler8,15 (fig. 3D). För fullständighetens skull har EzColocalization möjlighet att beräkna metriska matriser för två reporterkanaler med hjälp av fem andra mått: tröskelöverlappningspoäng med logaritmisk skalning8, Pearsonkorrelationskoefficient (PCC), Manders kolokaliseringskoefficienter (M1 och M2), Spearmans rangkorrelationskoefficient (SRCC) och intensitetskorrelationskvot (ICQ)8,15. Kolokalisering för tre kanaler kan också mätas med hjälp av ICQ, Manders kolokaliseringskoefficienter och TOS29 (kompletterande information).

Tröskelvärden för alla mätvärden mäts som den övre percentilen (FT) av pixlar för signalintensitet8,15. FT = 0,1 är till exempel 10 % av pixlarna med den högsta signalen. För de metriska matriserna används FT också för att ange stegstorleken för tröskelkombinationerna. Det vill säga FT = 0,1 väljer också tröskelvärden för 10 %, 20 %, … och 100 % av pixlarna med den högsta signalen. Om FT inte delas jämnt i 100 är den återstående procenten den sista stegstorleken. För mätvärden som inte behöver något tröskelvärde (dvs. PCC, SRCC och ICQ) beräknas värdena genom att anta att endast de pixlar som ligger över tröskelvärdena existerar. Fönstret för metrisk matris har alternativ för att resultaten ska sparas som text eller bild, för att ändra FT eller typ av metrik, för att visa enskilda cellers metriska värden som en lista och för att beräkna medelvärdet, medianen eller läget för metrik för varje tröskelkombination. Knappen ”Proc” (bearbetad) och ”Raw” (obearbetad) avgör om den lista med data som visas, kopieras eller sparas med knapparna ”List” (lista), ”Copy” (kopiera) respektive ”Save…” (spara) är medelvärdet för provet för varje tröskelkombination (t.ex. medianvärdet) eller alla värden för varje cell i provet för alla tröskelkombinationer.

Analys

Fliken ”Analysis” (analys) har tre underflikar (”Analysis Metrics” (analysmetriker), ”Metrics Info” (information om metriker) och ”Custom” (egen)). Underfliken Analysis Metrics har sex mätvärden för att mäta kolokalisering för två rapportörer (fig. 4A) och tre mätvärden för tre rapportörer (se föregående avsnitt). Användarna kan välja ett tröskelvärde eller inget tröskelvärde för PCC, SRCC och ICQ. TOS och Manders kolokaliseringskoefficienter måste ha ett tröskelvärde för att kunna beräknas. Underfliken Metrics Info innehåller information och resurser om de mätvärden som används i underfliken Analysis Metrics (mer detaljer i den kompletterande informationen). Tröskelvärden kan väljas med Costes metod30 eller manuellt. I underfliken Custom (se tilläggsinformation för mer information) kan användaren skriva sin egen kod i JavaTM för att analysera bilder (observera: exemplet som tillhandahålls är för beräkning av PCC) (fig. 4B). Knappen ”Compile” testar koden och skapar en temporär fil i Javas temporära katalog och visar resultatet av kompileringen med en etikett ”Succeeded” eller ”Failed”. Om det lyckas läses den kompilerade anpassade koden in i minnet igen och tillämpas på de valda cellerna.

Utgången av varje analys är en tabell som anger bilden och ett identifieringsnummer för varje cell (fig. 4C), och för varje cell anges värden för: (i) det valda måttet, (ii) fysiska parametrar och (iii) genomsnittlig signalintensitet för varje kanal (om valt). Observera: ”NaN” i resultattabellen anger att det inte går att beräkna ett värde. Användarna kan också generera sammanfattningsfönster (med cellnummer, medelvärde, median och standardavvikelse för det valda måttet) (fig. 4D), histogram av måttvärden (fig. 4E), binära maskbilder och en lista över ROI:er som representerar varje cells position och nummer på varje bild i ROI-hanteraren. ROI-listor och binära maskbilder kan sparas för återanalys av samma celler.

Användningar av EzColocalization

EzColocalization är utformad för att kunna användas på ett modulärt sätt för att underlätta anpassningen av analyser för en mängd olika experiment och forskares behov. Det här avsnittet fokuserar på att demonstrera specifika verktyg i EzColocalization för att lösa verkliga problem i olika bilduppsättningar.

I den första tillämpningen av EzColocalization används bilder av hippocampala neuroner hos råtta från Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, som tillskrivs Dieter Brandner och Ginger Withers) för att demonstrera: (I) användning av en reporterkanal för cellidentifiering när ett experiment inte har separata icke-reporterbilder för cellidentifiering, ii) cellfilter för att välja celler och iii) visualiseringsverktyg för att välja mätvärden. Arbetsflödet för analysen beskrivs i figur 5A. I det första steget skapades två reporterbildstaplar: en stapel med bilder där F-actin är märkt (med hjälp av en phalloidinpeptid konjugerad till rhodamin) och den andra stapeln med bilder där tubulin är märkt (med hjälp av en antikropp konjugerad till Alexa 488) (fig. 5B). Samspelet mellan F-actin och tubulin är viktigt för neuronernas tillväxt och migration31,32. Vi använde F-actinbilderna för cellidentifiering eftersom det finns i alla celler och visar cellgränserna8. Enskilda celler valdes ut från F-actinbilderna genom att tillämpa ett tröskelvärde för att identifiera celler24 och genom att använda ett cellfilter för att avlägsna cellrester (observera: parametervärden i fig. 5A).

När cellerna valts ut undersöktes intensiteten av reportersignaler med hjälp av cellulära värmekartor och scatterplots. Vi fann att reportrarna inte samlokaliserades vid höga signalnivåer och att det fanns ett komplext förhållande mellan signalintensiteterna (Fig. 5C,D). På grund av det sistnämnda kvantifierades lokaliseringen med hjälp av Manders M1 och M2 och TOS (kompletterande information). M1 och M2 utvärderades vid tröskelvärden som valts med Costes metod för den cell som beskrivs i fig. 5B, och värdena var 0,289 respektive 0,995. Dessa värden brukar tolkas som att tubulin har hög kolokalisering med F-actin och F-actin har låg kolokalisering med tubulin. TOS-värdena utvärderades genom att generera en metrisk matris med medianvärden för TOS. Matrisen visade kolokalisering, antikolokalisering och icke-kolokalisering vid olika tröskelvärden för signalintensiteterna för tubulin och F-actin (fig. 5E). På platser i celler där F-actin och tubulin har den högsta intensitetssignalen (översta 10 % av pixlarna för varje kanal) är medianvärdet för TOS -0,36 (n = 20). Detta negativa värde indikerar antikolokalisering, vilket stämmer överens med det intryck som erhålls från värmekartorna och spridningsdiagrammen och med andra rapporter8.

I den andra ansökan hämtades bilder av Saccharomyces cerevisiae som genomgår mitos från Cell Image Library33 för att visa: (i) identifiering av celler med hjälp av handritade konturer (för experiment där automatiserade metoder för identifiering av celler inte kan tillämpas), och (ii) bildjustering. Inmatningen av rapporteringsdata var en bild från en vildtypstam (”kontroll”; CIL: 13871) som har BFA1-proteinet som laddar TEM1 på spindelpolkroppen, och en bild från en stam utan BFA1-proteinet (∆bfa1 deletionsmutant; CIL: 13870). I dessa reporterbilder uttryckte cellerna TEM1-protein fusionerat med GFP och DNA var märkt med DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindol). TEM1 lokaliseras till spindelpolkroppar under mitos och är inblandad i utlösandet av utträdet ur mitos33. Arbetsgången visas i figur 6A. I denna tillämpning ritades ROIs manuellt runt cellerna med hjälp av urvalsverktyget ”Freehand” i ImageJ på DIC-bilder. Binära masker, som användes för att välja cellområden, skapades genom att välja ROIs och använda funktionerna ”Clear Outside” och sedan ”Auto Threshold” i ImageJ24 (fig. 6B). Cellområdena användes för cellidentifiering och för att korrigera anpassningen mellan DIC-bilderna och reporterkanalerna med hjälp av tröskelalgoritmen ”Default” (fig. 6C). Efter denna cellidentifiering och bildjustering är bilderna nu redo för visualisering och analys enligt beskrivningen i föregående exempel.

I den tredje tillämpningen användes bilder av hela vuxna Caenorhabditis elegans som erhållits från Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 för att visa att: (i) EzColocalization kan analysera kolokalisering i hela organismer, och (ii) ”cell”-filter kan välja ut enskilda organismer baserat på signalintensiteten hos reportern. Bilderna i det här exemplet kommer från samma dataset som användes i vår studie som beskriver TOS (men det är inte samma bilder)8. Arbetsflödet visas i figur 7A. Konturer av enskilda C. elegans ritades i ImageJ på ljusfältsbilder för att skapa ROI:er, och ROI:erna lades till ROI-hanteraren för identifiering av ”celler”. GFP uttryckt från clec-60-promotorn i den främre tarmen var reporter 1 och mCherry uttryckt från myo-2-promotorn i svalget, som är ett organ intill den främre tarmen35 , var reporter 2. Cellfilter för fysiska parametrar var onödiga eftersom endast de objekt som ansågs vara lämpliga C. elegans hade konturer ritade runt dem i första hand. Cellfilter för signalintensitet var dock nödvändiga eftersom vissa C. elegans hade låg GFP-signal, eventuellt på grund av att transgenen tystats36,37 (fig. 7B). Efterföljande visualisering och analys kan utföras enligt beskrivningen i den första tillämpningen.

I den fjärde tillämpningen visar vi analysen av kolokalisering för tre reporterkanaler. Arbetsflödet var detsamma som för två reporterkanaler förutom att ”3 reporterkanaler” först valdes i huvudmenyn ”Inställningar” (Fig. 8A). Bilderna hämtades från Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) av U2OS bencancerceller (n = 66)38. De tre reporterbilderna hade DNA, endoplasmatiskt retikulum (ER) respektive mitokondrier färgade med Hoechst 33342, concanavalin A/Alexa Fluor488-konjugat och MitoTracker Deep Red (övre raden, fig. 8B). Cellidentifiering utfördes med en bild av plasmamembranet märkt med vetegroddsagglutinin (WGA)/Alexa Fluor 555-konjugat (övre vänster, fig. 8B). Observera: Bilden hade även Golgiapparaten och F-actin-nätverket märkta38. Plasmamembranet spårades med hjälp av polygonvalsverktyget i ImageJ för att skapa ROI:er för de enskilda cellerna, och ROI-hanteraren som innehöll ROI:erna valdes för cellidentifiering.

Lokaliseringsmönstren visualiserades på samma sätt som för två rapportörer förutom att: (i) det finns tre uppsättningar värmekartor för rapportörerna i stället för två (nedre raden, fig. 8B) och (ii) scatterplots och metriska matriser är tredimensionella (fig. 8C-F). Det finns möjlighet i fliken Visualisering och fliken Analys (fig. 8G) att mäta kolokalisering för de tre rapportörerna med hjälp av ICQ, TOS eller Manders M1-, M2- och M3-metriker. Av de tre mätvärdena fann vi att TOS var lättast att tolka. TOS har ett enda värde för att mäta kolokaliseringen av alla tre reportersignalerna, och det visade tydligt att reportersignalerna för kärnan, mitokondrierna och ER överlappade varandra vid låga tröskelvärden (dvs. vid höga FT-värden finns det kolokalisering; röd färg i fig. 8E) och att de inte överlappade varandra vid höga tröskelvärden (dvs. vid låga FT-värden finns det antikolokalisering; blå färg i fig. 8E). Dessa observationer stämmer överens med att kärnan, mitokondrierna och ER-organellerna överlappar varandra i sina kanter (där signalen från deras rapportörer typiskt sett är lägre) på grund av kända fysiska interaktioner, men inte i sina centra (där signalen från deras rapportörer typiskt sett är högre) eftersom de är distinkta strukturer i cellerna39,40,41.