Evolutionär analys av gyrA-genen från Neisseria meningitidis bakteriestammar i klonkomplex 4821 insamlade i Kina mellan 1978 och 2016

Evolutionär analys av 77 gyrA-nukleotidsekvenser från CC4821 N.meningitidis-stammar

Sjuttiosju de novo gyrA-sekvenser från CC4821 N. meningitidis analyserades i samband med 149 offentligt tillgängliga gyrA-sekvenser (listade i tilläggstabell 1). Ett fylogenetiskt träd med grannsamverkan konstruerades med det resulterande datasetet av 226 gyrA-nukleotidsekvenser (fig. 1). Ett liknande träd erhölls med hjälp av maximum likelihood-metoden (ML) (ytterligare figur 1). Nukleotidsekvenserna var signifikant divergerande med ett totalt p-avstånd på 0,045 (tabell 1). En översikt över trädet visade att sekvenserna från CC4821 N.meningitidis-stammar (i rött i figur 1) återfanns över hela trädet, vilket visar att gyrA-genen var relativt divergent inom dessa stammar.

Neighbor joining phylogenetic tree of 226 gyrA-genensekvenser från Neisseria-stammar. Stammarnas namn anges på följande sätt: artnamn-GB ID-stam-ID-ST-CC-Serogrupp-insamlingsland-insamlingsår-insamlings-CIP-resistensfenotyp. Saknad information anges med ett tomt utrymme. Exempel: N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Tyskland-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Sydkorea-2017. Sekvensnamnen från CC4821 N.meningitidis-stammar anges med rött typsnitt. De 77 sekvenser som genererats i denna studie är understrukna. Sekvenserna från 9 referensstammar anges med en svart prick. Bootstrap-värden > 70 % anges. Bootstrap-värden < 70 % anges inom parentes vid behov. De nio genetiska grupper som identifierats i denna studie anges med vertikala linjer inom parentes. CIP-resistensfenotyp anges med R för resistens, S för känslig och I för intermediär resistensfenotyp

Av de 226 analyserade sekvenserna återfanns nästan 62 % av sekvenserna (140) högst upp i trädet, utan något signifikant bootstrap-värde (fig. 1). Dessa sekvenser var mycket homogena, med ett p-avstånd på 0,003 (tabell 1). De återstående 86 sekvenserna var mer divergerande, med ett p-avstånd på 0,066 i förhållande till de sekvenser som var grupperade i trädets topp. De flesta av noderna för dessa 86 sekvenser hade ett bootstrap-värde > 70 %. Dessutom var p-avståndet inom denna grupp av 86 sekvenser 0,09, vilket visar att dessa sekvenser var mycket divergerande mellan varandra. Eftersom de viktigaste noderna i trädet uppvisade ett bootstrap-värde > 80 %, beslutade vi att godtyckligt tilldela sekvenserna till nio olika genetiska grupper (fig. 1; tabell 1). Dessa 9 grupper återfanns också i ML-trädet (ytterligare figur 1). GyrA-sekvenserna från CC4821-stammar återfanns i 6 av dessa genetiska grupper nämligen grupp 1, 2, 3, 5, 6 och 8.

Grupp 1 bestod av 2 sekvenser, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 och N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Denna grupp stöddes av ett bootstrap på 100 %, vilket tyder på att dessa två sekvenser skiljer sig mycket från resten av sekvenserna. Sekvenserna delade 7 aminoändringar (tabell 1, tilläggstabell 2). Den långa grenen som motsvarar sekvensen N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 tydde dock på att denna sekvens också skiljde sig avsevärt från N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 och detta bekräftades av ett p-avstånd på 0,06 mellan dessa 2 sekvenser (tabell 1).

Grupp 2 bestod av 2 sekvenser från N.meningitidis-stammar som samlades in i provinserna Gansu och Guangxi i Kina 2007 och 2011, nämligen N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R och N. meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Grupp 3 bestod av en enda sekvens, nämligen N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Den nod som motsvarar denna sekvens stöddes av ett bootstrapvärde på 80 %. Dessutom var det lägsta parvisa p-avståndet mellan denna sekvens och de andra analyserade sekvenserna 0,032, vilket visar att denna sekvens var signifikant avvikande jämfört med resten av de analyserade sekvenserna (tabell 1).

Grupp 5 bestod av 26 sekvenser, huvudsakligen från N.meningitidis, inklusive 9 från CC4821. En undergrupp med 7 sekvenser som stöddes av ett bootstrap på 100 % innehöll 5 sekvenser från N.lactamica. Intressant är att N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 klustrade med N.lactamica-sekvenser med ett bootstrap på 100 % och en lång gren.

Grupp 6 bestod av 27 sekvenser från N.meningitidis (8 från CC4821) och 1 sekvens från N. cinerea, nämligen N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, som delade en nod med N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. N.cinerea-sekvensen hade dock en lång gren som tyder på en betydande divergens jämfört med N.meningitidis-sekvensen. På grundval av de tillgängliga uppgifterna verkade sekvenserna från grupp 6 komma från stammar som var resistenta mot CIP. Ingen unik aminosyrasubstitution delades dock av dessa stammar, vilket tyder på att det inte fanns någon gemensam markör för resistensfenotypen hos dessa stammar (tilläggstabell 2).

Grupp 8 innehöll de flesta av de N.meningitidis-sekvenser (64 %) som analyserades i denna rapport. Stammarna samlades in under de senaste 88 åren i 13 olika länder från fyra kontinenter. Trots den betydande tidsperioden och den geografiska spridningen var dessa sekvenser mycket konserverade med ett p-avstånd på 0,003. Dessutom kom sekvenserna från stammar från 68 ST-stammar, 24 CC-stammar, 9 serogrupper, inklusive referensstammen 053442. Sammantaget visade dessa observationer att gyrA-genen var mycket konserverad bland de flesta N.meningitidis-stammar trots olika genetiska egenskaper, geografiska platser eller insamlingstid.

Analys av divergensen inom GyrA-proteinet

Aminosyradivergensen inom GyrA-proteinet analyserades bland 129 unika sekvenser (Additional Table 2). Tvåhundrafemtiosju divergerande positioner identifierades bland de 931 aminosyror som fanns i anpassningen (fig. 2). Även om dessa platser återfanns över hela proteinet verkade divergensens fördelning inte vara slumpmässig. I själva verket var två regioner mycket konserverade, från positionerna 530 till 620 och en mindre region mellan 300 och 330. Enligt proteinet från E.coli motsvarar den första regionen slutet av den aminoterminala domänen och början av den karboxyterminala domänen. Den andra regionen motsvarar proteinets torndomän baserat på 3D-modellstrukturen (fig. 2).

Aminosyradivergens bland GyrA-proteinet baserat på 129 unika sekvenser. Positionerna inom den 932 aminosyror långa anpassningen anges på X-axeln. Procentandelen sekvenser med en viss avvikande position anges på Y-axeln (vänster sida). Till exempel har 58 % av sekvenserna en mutation vid position 91. Divergensdiagrammet genererades från den tabell över aminosyraskillnader som visas i tilläggstabell 2. I anpassningen finns 10 luckor och antalet sekvenser med luckor anges på den högra axeln och visas som en svart fyrkant. En karta över E.coli GyrA-proteinet med strukturella och funktionella domäner visas i botten för jämförelse. Kartan skapades på grundval av följande referenser . GyrA-proteinsekvensen från E.coli och N.meningitidis referensstam 053442 (GB-ID CP000381) jämfördes (tilläggstabell 4). Den kända CIP-resistenta platsen i E.coli visas och motsvarande positioner i N.meningitidis anges med en blå linje. Det är värt att notera att bland de 8 resistenta platserna som rapporterats i E.coli är endast positionerna 83 och 87 divergerande i N.meningitidis (platserna 91 och 95)

Av de 257 divergerande positionerna var det ingen som delades av alla de analyserade gyrA-sekvenserna från CC4821-stammarna. Fem platser (91, 417, 665, 210 och 288) var mycket divergerande, 40 % eller mer av de 129 sekvenserna var muterade vid dessa positioner. Till exempel hade 48 % av de 129 sekvenserna en muterad rest vid position 417 (fig. 2). En position (91) verkade vara kopplad till CIP-resistens, alla stammar som inte var känsliga för CIP var muterade vid denna position, med antingen ett I eller ett F eller ett V (tilläggstabell 2).

Identifiering av potentiella resistensmarkörer för CIP

Av de 226 analyserade sekvenserna kom 174 från stammar som testats för resistens mot CIP (tilläggstabell 1). Sjuttiosju stammar testades för den här studien. Som nämnts ovan var alla stammar som inte var känsliga för CIP (antingen med en resistent fenotyp (R i trädet) eller en intermediär fenotyp (I i trädet)) muterade i position 91. Det visade att en mutation i position 91 var kopplad till resistensmekanismen. Av de 67 stammar som testades i denna studie var 49 muterade i position 91, men 23 av dessa stammar hade en intermediär resistensfenotyp. Detta tyder på att andra positioner kan vara inblandade i resistensmekanismen. För att identifiera ytterligare potentiella markörer för resistens analyserades de 226 stammarna ytterligare vid varje muterad position. En förändring som skulle hittas i resistenta stammar (inklusive intermediär resistensfenotyp) men som inte hittas i några känsliga stammar skulle komma i fråga. För att öka stringensen i analysen skulle dock en mutation som endast hittats i en stam inte beaktas. Sammanlagt identifierades 33 platser (tilläggstabell 3; vänster sida i tilläggstabell 4). H8N hittades t.ex. i 18 resistenta stammar (inklusive 2 med intermediär fenotyp) men inte i några känsliga stammar. Alla 226 stammar analyserades för dessa 33 positioner. För att öka strängheten i analysen skulle återigen en mutation som finns i minst en känslig stam förkastas. Mutationen D95N som fanns både i resistenta och känsliga stammar beaktades därför inte ytterligare. Sammanlagt analyserades 39 mutationer (vissa på samma position som position 91) (i grönt på vänster sida i tilläggstabell 4). En mutationsprofil byggdes upp för de 128 stammar som innehöll minst en mutation av intresse (tilläggstabell 3). Fyrtiosex olika profiler identifierades, vilket innebär att det fanns 46 kombinationer av dessa 39 mutationer bland alla analyserade stammar (höger sida i tilläggstabell 4). Sexton av de 46 mutationsprofilerna gällde CC4821-stammar (nummer i rött i tilläggstabell 4). Tjugosex profiler gällde stammar som var kända för att vara CIP-resistenta (stamnamn i blått typsnitt i tilläggstabell 4). Bland de 39 potentiella resistensmarkörerna var mutationerna N103D och T91I de mest delade i profilerna med 29 respektive 27 förekomster. Det är dock värt att notera att andra mutationer också var väl representerade, t.ex. H8N, I111V, E793Q och A679S med 23, 21, 18 respektive 17 förekomster. Det är också värt att notera att 45 % av de resistenta stammarna (58 av 128) uppvisade endast mutationen T91I. Eftersom resistensmarkörer ursprungligen beskrevs i E.coli var en jämförelse mellan gyrA-sekvenser från E.coli och referensstammen N.meningitidis 53 442 nödvändig för att kontrollera dessa markörers position i E.coli-sekvensen (tilläggstabell 5).

Rekombination inom gyrA-genen mellan N. spp.

Den fylogenetiska analysen identifierade potentiella rekombinanter. Till exempel var grupp 1 av särskilt intresse, som berörde N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 och N.subflava-CP031251.1-M18660. Dessa två sekvenser hade 7 gemensamma förändringar av rester, som inte har setts i andra stammar. Dessutom sågs 5 av dessa förändringar inom 30 aminosyror (tabell 1). Slutligen sågs aminosyraförändringar som observerades i en stam inte i den andra stammen, som position 740 och 750. Alla dessa observationer tyder på en rekombination mellan dessa två stammar, vilket bekräftades av en BootScan-analys (fig. 3a). Tre andra potentiella rekombinationer bekräftades av BootScan. I figur 3b beskrivs en rekombination mellan en CC4821-stam (sannolikt antingen N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 eller N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) och N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. Figur 3c visar flera rekombinationshändelser mellan N.lactamica-CP031253.1-M17106—– och två N.meningitidis-stammar, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– och N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Slutligen visas en rekombination mellan N. meningitidis-stammar i figur 3d. Sammantaget visade rekombinationsanalysen att gyrA-genen hos Neisseria-stammar är mycket benägen för rekombination.

Potentiella rekombinationshändelser mellan och inom arter bland Neisseria-stammar. a. Rekombination mellan N.subflava och N.meningitidis. En BootScan-plott genererades i SimPlot med N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 som fråga. b. Rekombination mellan N.cinerea och N.meningitidis. En BootScan-plott genererades i SimPlot med N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R som fråga. c. Rekombination mellan N.lactamica och N.meningitidis. En BootScan-plott genererades i SimPlot med N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 som fråga. d. Rekombination mellan N.meningitidis-stammar. En BootScan-plott genererades i SimPlot med N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 som fråga. Den stam som förutspås bidra mest till rekombinationsprocessen (backbone) visas som en röd linje. N. meningitidis-referensstam 053442 (GB ID CP000381) visas som en svart linje. En funktionskarta för referensstammen 053442 visas ovan baserat på den funktionskarta för E.coli som visas i figur 2

.