Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD)

2.1 Proteinveckningsprocess och identifiering av felveckade proteiner

Omkring 30 % av cellens totala proteiner och alla transmembranproteiner syntetiseras i ER, som fungerar som en portal för inträde i den sekretoriska vägen via Sec61-kanalen . När den translokaliseras klyvs den N-terminala hydrofoba signalsekvensen i det nysyntetiserade proteinet av ett peptidaskomplex . Co- och posttranslationella modifieringar såsom bildning av disulfidbindningar, inledande steg av N-glykosylering och förankring av glykofosfatidylinositol (GPI) äger rum i ER.

Den oxiderande miljön i ER underlättar bildandet av disulfidbindningar, vilket stabiliserar den tertiära proteinstrukturen och underlättar proteinsammansättningen. Under veckningsprocessen bildas disulfidbindningar genom oxidation av par av fria tioler på cysteinrester av proteindisulfidisomeraser (PDI). PDI:er fungerar som cykler, och efter den inledande oxideringen isomeriseras disulfidbindningarna ibland av PDI och ERp57, som är ett tioloxidoreduktas, för att stabilisera den korrekta veckningen av proteinet . Omvänt är reduktionen av disulfidbindningar hos felveckade proteiner nödvändig för ERAD:s retrotranslokationssteg. PDI möjliggör retrotranslokation av simian virüs-40 (SV-40) och koleratoxin . ERdj5, ett ER-oxidoreduktas, reducerar disulfidbindningar och interagerar med EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) och påskyndar också retrotranslokationen av SV-40 . ERDJ5 reglerar också nedbrytningen av den sjukdomsframkallande α1-antitrypsinvarianten (null Hong Kong) .

Fällningen underlättas av molekylära chaperoner som hjälper till mot felveckning och utveckning. Chaperonliknande glykaner binder till N-glykaner som spelar en avgörande roll vid proteinveckning och nedbrytning. Det är uppenbart att N-glykosylering, kvalitetskontroll av proteinveckning och ERAD är funktionellt sammankopplade. Efter att ha kommit in i ER är en stor majoritet av de nysyntetiserade polypeptidkedjorna N-länkade glykosylerade. Enzymet oligosackaryltransferas känner igen Asn-X-Ser/Thr-konsensussekvensen i den mest framväxande proteinmolekylen och integrerar kovalent en kärnglykangrupp med hög mannoshalt (Glc3Man9GlcNAc2) från dolichol som är lokaliserad på ER-membranet till proteinet. På grund av den mycket korta halveringstiden för den triglykosylerade formen av proteinbundna oligosackarider börjar bearbetningen av glykaner omedelbart efter överföringen av glykangrupper från prekursorerna genom glukosidasenzymer. Efter klyvning av två av tre glukosrester kan det framväxande proteinet interagera med kvalitetskontrolllektiner som CNX och CLR. Denna interaktion bibehålls till dess att resterande glukosrester klyvs. Efter att ha frigjort glykoproteinet från CNX/CLR-cykeln, klipps också den sista glukosresterna av och skapar ett oglykosylerat substrat. Detta äventyrar substratets interaktion med lektin-chaperonerna. I detta skede kan proteinet, om det är korrekt veckat, lämna ER för sin slutliga destination. Om glykoproteinet fortfarande är oveckat behålls det dock i ER och återkokosyleras av UDP-glukos:glykoproteinglukosyltransferas och återknyter med CNX och CLR, vilket ger proteinet mer tid för korrekt veckning. Man har ännu inte förstått vilka mekanismer som är inblandade i avslutandet av reglykosylerings-/deglykosyleringscyklerna. Det står dock klart att om polypeptidkedjan inte kan nå sin mogna form efter upprepade vikningsförsök avlägsnas terminala mannosarester från kärnglykankedjan gradvis av ER α1,2-mannosidas I (ERMan1). ERMan1 producerar Man8GlcNAc2-isomeren genom att ta bort en mannosrest från den mellersta grenen av N-glykaner. Genom denna trimning blir glykoprotein sämre substrat för reglykosylering och utträde ur CNX-cykeln .

De hydrofoba fläckarna i korrekt veckade proteiner är vanligtvis begravda i det inre av lösliga proteiner. Dessa fläckar kan dock exponeras i felveckade proteiner. Om ett protein har exponerade hydrofoba ytor binder BiP till det för att dölja dessa aggregationsbenägna ytor för korrekta veckningsförsök genom att förhindra aggregering. Om vikningen inte lyckas eller fördröjs tjänar dock en utökad interaktion mellan chaperon och felveckat protein till en sofistikerad process där proteinet överförs till andra chaperoner och/eller till ERAD-processen .

Det är väl accepterat att ERAD:s första steg är att chaperonerna selekterar felveckade proteiner. Redan 1999 upptäckte man att ERAD-substrat från jäst skiljer sig markant åt när det gäller deras krav på den ER-luminala Hsp70, BiP . Nedbrytningen av lösliga substrat som pαF och en mutantform av det vakuolära proteaset carboxypeptidas Y* (CPY*) var beroende av BiP, medan nedbrytningen av transmembranproteinerna Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p och Hmg2p skedde på ett BiP-oberoende sätt. År 2004 har det visats att substrat med cytosolisk domän som Ste6-166p bröts ner BiP-oberoende, medan proteiner med luminal defekt krävde BiP, vilket tyder på att beroende på topologin hos den felveckade skadan (ER-lumen, ER-membran och cytoplasma) fungerar cytosoliska eller luminala chaperoner vid igenkänning och målinriktning för nedbrytning .

Det är möjligt att studera substratigenkänning under ERAD med hjälp av modeller av felveckade proteiner. Det är tydligt att de-mannosylering krävs för nedbrytning av felveckade glykoproteiner eftersom hämning av denna mannosetrimning stabiliserar felveckade glykoproteiner i ER . Övexpression av ERMan1 påskyndar nedbrytningen av N-glykosylerade proteiner . Det resulterande Man8-GlcNAc2-haltiga glykoproteinet efter denna trimning blir ett substrat för EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p i jäst) – en mannosidasrelaterad lektin i ER. Det föreslogs vidare att felveckade glykoproteiner interagerar med ERManI och EDEM1 för deras ERAD, och att interaktionen mellan lektin och kolhydrater visade sig vara avgörande för EDEM:s substratigenkänning. Även om ERMan1 föreslogs vara en biologisk timer som initierar ERAD av felveckade proteiner, visade nya studier att mannosidaser inte enbart är ansvariga för intensiv demannosylering under ERAD, särskilt under icke basala förhållanden. Under ER-stress (unfolded protein response active) ökar transkriptionen av EDEM1 ERAD-effektiviteten genom att undertrycka proteolytisk nedreglering av ERMan1 . Det visade sig att EDEM också spelar en viktig roll för demannosylering av substrat . EDEM1 förhindrar också reglykosylering och främjar retrotranslokation och nedbrytning av vissa ERAD-substrat . Å andra sidan, medan mannosidasets homologidomän (MHD) av Htm1p är nödvändig för substratbindning, binder EDEM1 från däggdjur felveckade proteiner oberoende av MHD-domänen, och därför kanske EDEM1:s substratbindning inte kräver mannosetrimning eller till och med glykosylering . Förutom N-länkade oligosackariddelar i glykoproteiner kan EDEM1 således känna igen veckningsskador hos felveckade proteiner. Sammanfattningsvis är EDEM direkt eller indirekt involverade i demannosylering av glykoproteiner och/eller fungerar som receptorer som binder och riktar mannosetrimmade proteiner till ERAD (figur 1).

Trunkering av terminal mannos från gren C exponerar α-terminala α1,6-bundna mannosrester som fungerar som en igenkänningssignal för ERAD-lektiner som OS9 (Yos9 i jäst) och XTP3-B (figur 2). Genom sin mannose-6-fosfatreceptorhomologidomän (MRH) känner båda proteinerna främst igen α1,6-bunden mannos j. Dessutom känner OS-9 också igen α1,6-bunden mannos e och c .

Flera rapporter tyder på att faktorer (EDEMs, OS9 och XTP3-B) som krävs för substratigenkänning och målinriktning finns i supramolekylära komplex och/eller interagerar med viktiga ERAD-regulatorer . EDEM1 interagerar till exempel med CNX, tar emot substrat från CNX-cykeln och underlättar nedbrytning av ERAD-substrat, till exempel NHK-α1-antitrypsinmutant . EDEM1 associerar också med komponenterna i ER retrotranslokationsmaskineriet. Det föreslås att EDEM1 binder felveckade proteiner och använder sin MHD-domän för att rikta avvikande proteiner till det ER-residenta glykoproteinet SEL1L-proteinet i ubiquitinligaskomplexet Hrd1-SEL1L . SEL1L är en del av flera luminal substratigenkänningsfaktorer och kopplar dem till Hrd1. OS9 och XTP3-B associerar också med Hrd1-SEL1L-komplexet, som också omfattar BiP och GRP94 . Dessutom föreslås XTP3-B koppla samman BiP med Hrd1-komplexet . Enligt en hypotes fungerar dessa tre chaperoner (EDEM1, OS9 och XTP3-B) som oligomerer, där en monomer interagerar med substratet och en annan med Hrd1-SEL1L-komplexet . Dessutom interagerar EDEM1 också med Derlins, ett transmembranprotein som är en kandidat för translocon ; dessutom har Derlin2 visat sig förstärka EDEM1:s interaktion med ett cytosoliskt AAA-ATPas p97, som kopplar ATP-hydrolys till retrotranslokation av felveckade proteiner .

Det är uppenbart att ERAD:s steg för substratigenkänning är en komplicerad mekanism, där flera olika enzymer och chaperoner som har skilda men samordnade roller i ERAD är inblandade. Beroende på substrat varierar dessutom antalet och egenskaperna hos de inblandade proteinerna. Det har till exempel föreslagits att EDEM, ERdj5 och BiP har samordnade roller i nedbrytningen av felveckade proteiner. Efter att ha lämnat CNX-CLR-cykeln trimmar EDEM1 ytterligare Man8-GlcNAc2-glykanstrukturen och ERdj5 minskar disulfatbindningarna. Samtidigt aktiverar ERdj5 BiP:s ATPasaktivitet. ADP-bunden BiP binder till det felveckade proteinet och håller det i en retrotranslokationskomponentform tills det överförs till retrotranslokationskomplexet .

ERAD är också involverad i kvalitetskontrollen av icke-glykosylerade proteiner, vilket är oberoende av lektinliknande proteiner. Immunoglobulin light chain (Ig-K-LC), ett icke-glykosylerat ERAD-substrat, bryts ned på ett BiP-beroende sätt. Okuda-Shimizu och Hendershot har karakteriserat en ERAD-väg för detta icke-glykosylerade BiP-substrat och olika proteininteraktionsdynamiker som anses spela en roll i denna process. Ig-K-LC har två intramolekylära disulfidbindningar, och dess fullständigt oxiderade form har inte förmåga att passera från ER till cytoplasman. BiP interagerar endast med den delvis oxiderade formen av Ig, vilket förhindrar fullständig oxidation av Ig-K-LC och därmed underlättar dess frigörelse från ER . Dessutom har ett transmembranprotein som innehåller en UBL-domän, homoCys-responsive ER-resident protein (HERP), identifierats som en receptor för icke-glykosylerade BiP-substrat . HERP interagerar med Derlin1, och det delvis oxiderade Ig-K-LC överförs från BiP till HERP-Derlin1-Hrd1-komplexet och leds därefter till proteasomal nedbrytning . Förutom BiP anges även ERdj5 som disulfidreduktas vara viktigt för ERAD av icke-glykosylerade proteiner . De icke-glykosylerade substrat som fångas upp av BiP överförs till ERdj5 för klyvning av disulfidbindningar. Därefter överförs dessa substrat till SEL1L med hjälp av BiP för retrotranslokation. Förutom BiP har både OS9 och XTP3-B involverats i ERAD av icke-glykosylerade proteiner.