En universell heparinantidot med försumbar effekt på fibrin(ogen) och plasmakoagulation

Bakgrund och mål

Antikoagulantia spelar en central roll i behandlingen av tromboemboliska sjukdomar. Blödning hos kirurgiska patienter som får antikoagulantia är ett stort problem. Antidoter administreras för att motverka antikoagulationen och återställa normal hemostas. Hittills är protaminsulfat (PS), en katjonisk polypeptid, den enda kliniskt godkända antidoten för ofraktionerat heparin. PS har toxiska biverkningar och begränsningar. PS:s oförmåga att helt reversera hepariner med låg molekylvikt och fondaparinux beror på dess låga bindningsaffinitet till dessa läkemedel. PS interagerar dock med koagulationsproteiner som fibrinogen för att bilda aggregat som leder till kardiovaskulära biverkningar. Nyligen utvecklade vi ett syntetiskt universellt heparinomvändningsmedel (UHRA) med hög bindningsaffinitet till hepariner. In vivo-studier visade att UHRA fullständigt reverserar aktiviteten hos alla kliniskt tillgängliga parenterala antikoagulantia och att det inte är giftigt. Denna studie syftar till att visa att UHRA är icke-toxisk genom att bedöma dess inflytande på fibrinogen, fibrinklumparkitektur, plasmakoagulering och koagellysis.

Metoder

UHRA utvecklades genom att införliva tertiära aminbaserade heparinbindningsgrupper på en dendritisk hyperförgrenad polyglycerolställning och täcka den med metoxipolyetylenglykolkedjor. För att förstå UHRA:s inverkan på koagulationssystemet utfördes rekalcifierings- och vävnadsfaktor (TF)-initierade turbidimetriska plasmakoagulationsanalyser. UHRA:s interaktion med fibrinogen undersöktes genom fibrinogenaggregationsanalys, fibrinpolymeriseringsanalys och spektroskopisk analys (fluorescens och cirkulär dikroism (CD)). UHRA:s påverkan på fibrinproppens arkitektur utvärderades med hjälp av svepelektronmikroskopi (SEM).Den antikoagulanta neutraliseringen (hepariner) av UHRA undersöktes med hjälp av fluorogen trombingenereringstest (TGA) i mänsklig trombocytrik plasma (PRP). Lysis av TF-inducerad plasmakoagel innehållande UHRA eller PS som utsattes för exogen vävnadsplasminogenaktivator (t-PA) studerades genom turbidimetrisk analys.

Resultat och diskussion

Resultaten från plasmakoagulationsanalyserna visade att UHRA inte förändrade koagulationsparametrarna jämfört med PS (TF-initierad fördröjningstid och maximal absorbans, kontroll vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 respektive 0,16; fördröjningstid och maximal absorbans vid rekalcifiering, kontroll vs UHRA 200 mcg/mL, p=0,08 respektive 0,13), vilket tyder på att UHRA inte har någon effekt på koagulationssystemet vid den studerade koncentrationen (figur 1). Till skillnad från protamin påverkades inte fibrinogenaggregations- och fibrinpolymeriseringsanalysen av UHRA över ett brett koncentrationsområde från 0,05 mg/mL till 1 mg/mL. Tillsammans med mätningar av tryptofanfluorescensdämpning (figur 2) och mätningar av fibrinogens sekundärstruktur bekräftar detta att UHRA inte interagerar med fibrinogen. Resultaten skiljer sig helt från PS och andra syntetiska katjoniska polymerer som interagerar med fibrinogen och framkallar aggregering och konformationsförändringar. Fibrinproppar som genereras i närvaro av UHRA (även vid 0,5 mg/ml) uppvisar liknande struktur och fiberstorleken är densamma som för normala fibrinproppar (kontroll mot UHRA 0,5 mg/ml-propp, p= 0,12) (figur 3). Å andra sidan ökade fibrinproppar som bildades i närvaro av 0,05 mg/mL PS (klinisk dos) fiberstorleken och förändrade proppens struktur dramatiskt (kontroll vs PS 0,05 mg/mL-propp, p< 0,0001). Våra studier av plasmapropplysning i närvaro av exogent t-PA visar att UHRA inte ökade nedbrytningen av proppen till skillnad från protamin. UHRA återställde trombinnivåerna i antikoagulerad PRP (hepariniserad) vilket visar på effektiviteten.

Slutsats och betydelse

Våra studier visar att universell heparinantidot, UHRA, har försumbar inverkan på fibrinogen, fibrinpolymerisering, koagelstruktur, koagelnedbrytning och koagulationssystemet vilket avslöjar deras utmärkta hemokompatibilitet jämfört med protamin. Våra resultat stöder det faktum att UHRA skulle kunna vara en idealisk antidot för att återställa hemostas efter invasiva kirurgiska ingrepp och för att hantera blödningskomplikationer av heparinbaserade antikoagulantia.

Ingen relevanta intressekonflikter att deklarera.