ELISpot Assay Principle

ELISpot-analyser använder ELISA-tekniken (sandwich enzyme-linked immunosorbent assay). En monoklonal eller polyklonal antikropp som är specifik för den valda analyten är förbelagd på en PVDF-mikroplatta (polyvinylidendifluorid) med baksida. Lämpligt stimulerade celler pipetteras in i brunnarna och mikroplattan placeras i en befuktad 37 °C CO2-inkubator under en bestämd tidsperiod. Under denna inkubationsperiod binder den immobiliserade antikroppen, i omedelbar närhet av de utsöndrande cellerna, den utsöndrade analyten. Efter att ha tvättat bort eventuella celler och obundna ämnen tillsätts en biotinylerad polyklonal antikropp som är specifik för den valda analyten i brunnarna. Efter en tvätt för att avlägsna obundna biotinylerade antikroppar tillsätts alkaliskt fosfatas konjugerat till streptavidin. Obundet enzym avlägsnas därefter genom tvättning och en substratlösning (BCIP/NBT) tillsätts. En blåsvart färgad utfällning bildas och visas som fläckar på de platser där cytokinerna lokaliseras, där varje enskild fläck representerar en enskild cell som utsöndrar analyten. Fläckarna kan räknas med ett automatiserat ELISpot-läsarsystem eller manuellt med hjälp av ett stereomikroskop.