Elektroporation och konkurrerande transfektionsmetoder

Förutom direkt införande av gener underlättar elektroporation den direkta överföringen av plasmider mellan celler eller arter – till exempel från bakterier till jäst.

Det pågår ett omfattande experimenterande kring användningen av elektroporation för att leverera mediciner och vacciner direkt till cellerna i levande organismer. Denna artikel fokuserar på icke-medicinska tillämpningar.

Elektroporation används oftast för att transfektera celler övergående, även om stabil transfektion också är möjlig. Inom den biofarmaceutiska industrin möjliggör transient transfektion produktion av upp till några gram protein för karakterisering och prekliniska studier. I denna tillämpning har elektroporation med hjälp av plasmider visat sig vara tillförlitlig och förutsägbar. Elektroporation ger på liknande sätt stabilt transfekterade celler förutsatt att DNA införs i linjär form genom att det först behandlas med ett restriktionsenzym.

En teknik bland många

Elektroporation är fast etablerad i armamentariet av transfektionstekniker som inkluderar virala vektorer, kemiska eller reagensbaserade metoder och mekanisk genleverans. Virala vektorer är den vanligaste metoden för att generera stabilt transfekterade celler för tillverkning av terapeutiska proteiner. Virala vektorer ger en mycket hög transfektionseffektivitet men är begränsade när det gäller längden på det insatta DNA:t. Virala vektorer har också problem med biosäkerhet och mutagenes.

Andra mekaniska tekniker som mikroprecipitering, mikroinjektion, liposomer, partikelbombardemang, sonoporation, laserinducerad porering och transfektion med pärlor används alla experimentellt. Dessa mekaniska tekniker har en gemensam nämnare. De bryter cellmembranen och gör det därmed möjligt för DNA att komma in i cellen. Vissa metoder – till exempel ”genkanonen” – innebär att gener projiceras direkt genom membranet in i cytoplasman. Härifrån kan generna vandra till kärnan.

Det finns dessutom hybridtekniker som utnyttjar kapaciteten hos mekaniska och kemiska transfektionsmetoder. Till exempel har det under det senaste decenniet publicerats många artiklar om magnetoinfektion, en transfektionsmetod som kombinerar kemisk transfektion med mekaniska metoder. Kationiska lipider kan till exempel användas i kombination med genkanoner eller elektroporatorer. Det mesta av litteraturen om magnetoinfektion handlar om leverans av gener och terapeutiska molekyler till levande organismer.

Elektroporation har flera fördelar: mångsidighet (fungerar med alla celltyper), effektivitet, mycket lågt DNA-krav och förmågan att fungera i levande organismer. Nackdelar är potentiella cellskador och den ospecifika transporten av molekyler in i och ut ur cellen.

Men bland kemiska, mekaniska och virala transfektionsmetoder ger elektroporation i sig själv en rimlig säkerhet för framgång oavsett målcell eller organism.

Till exempel är kemisk transformation och elektroporation två ledande metoder för att föra in DNA i Escherichia coli. För den senare metoden måste bakterierna först göras ”kompetenta” genom att ta bort buffertsalter för att säkerställa att strömmen når cellerna, följt av applicering av den elektriska pulsen vid 0 °C för att minska skadorna på mikroorganismerna. Kemisk omvandling innebär suspension i CaCl2, vilket skapar porer, följt av en värmeschock som sveper in DNA i cellerna.

En annan metod använder katjoniska lipider för att öppna cellmembranen. Elektroporation är mindre besvärligt och effektivare, fungerar på mer varierande celltyper och lämpar sig lättare för standardmetoder än kemisk transfektion. Vissa forskare föredrar dock kemisk transfektion eftersom man då inte behöver köpa ett instrument.

Möjliggör innovation

Och även om elektroporation först beskrevs 1965, fortsätter elektroporation att öppna vägar mot innovativ vetenskap när det gäller instrumentering, protokoll och experiment. Minst ett dussin universitetsgrupper har utvecklat elektroporationsanordningar baserade på mikroelektromekaniska system (MEMS). En fördel med anordningar med mikrokanaler är att de kan utformas så att de inte ger mer spänning än vad som är tillräckligt för att uppnå en rimlig inbyggnad av makromolekyler. Denna fördel är också en nackdel. Till skillnad från kommersiella elektroporationssystem fungerar chipen inte med alla celler.

En grupp vid institutionen för biomedicinsk teknik vid Louisiana Tech University under ledning av Shengnian Wang, Ph.D., har funnit att guldnanopartiklar förbättrar prestandan hos kommersiella elektroporationsutrustningar.1 Wang tror att partiklarna, som är mycket ledande, minskar cellmediets ledningsförmåga samtidigt som de fungerar som ”virtuella mikroelektroder” för att hjälpa till att öppna fosfolipidmembranen. Han hävdar ökad prestanda (förbättrad effektivitet för DNA-leverans) och högre cellviabilitet i kraft av lägre porationsspänningar.

Forskare vid Charité Universitätsmedizin Berlin2 har utvecklat en kombinerad elektroporationsstrategi med kvadratiska pulser för reproducerbar transfektion av celler. Britta Siegmund och medarbetare suspenderar celler i buffert och utsätter dem för en första högspänningspuls följt av en lågspänningspuls med olika elektriska och tidsmässiga värden. Siegmund hävdar att livskraften är jämförbar med vanlig elektroporation och att transfektionseffektiviteten är upp till 95 %. Hon drar slutsatsen att tekniken kan ”lätt anpassas för celler som anses svåra att transfektera”

Inom vanlig DNA-överföring har transfektion använts för att införa interfererande RNA i olika celltyper. Tekniken gör det möjligt att i kontrollerad liten skala studera dosering och leveransens effektivitet. Problem med dosering och leverans har plågat praktiska tillämpningar av RNA-interferens i terapi. Men åtminstone en studie har ifrågasatt om RNA-interferensgener införlivas effektivast genom transfektionsreagens eller elektroporation i primära celler.3

Kirsty Jensen, Ph.D., och kollegor vid University of Edinburgh jämförde effektiviteten hos 11 kit med transfektionsreagens för övergående transfektion och elektroporation för att tysta ner den immunmodulerande genen för Medelhavsfeber (MEFV) i makrofager som härstammar från bovina monocyter. Gruppen testade metoder för upptag av small interfering RNA, knockdown av målgenen, celltoxicitet och induktion av interferonsvaret av typ I.

Elektroporation var ungefär lika effektivt för att slå ut MEFV som transfektionsreagens. Till skillnad från reagenserna inducerade elektroporation ingen interferonsvar, men cellviabiliteten var lägre. Frågor om viabilitet och transfektionseffektivitet för elektroporation tas i allmänhet som en nominell bedömning av tekniken.

Dr. Jensen drog slutsatsen att ”användningen av transfektionsreagens är lämpligare än elektroporation för vårt arbete med att undersöka rollen för värdens makrofaggener i svaret på en infektion”, men att ”valet mellan att transfektera eller elektroporera små interfererande RNA i celler beror på de enskilda experimenten”.”

I åtminstone några fall där elektroporationsresultaten är suboptimala har forskarna försummat att optimera andra förhållanden än den elektriska pulsstyrkan. Som nyligen påpekats av Hu och medarbetare4 påverkas elektroporationens effektivitet av icke-elektriska faktorer såsom cell- eller vävnadstyp och DNA-formulering.

Elektroporation har blivit en oumbärlig metod för både in vitro- och in vivo-utvecklingsbiologi. En stor del av detta arbete sker i enskilda celler, vilket bidrar till en modell av stort intresse inom terapi, diagnostik, läkemedelsleverans och cellbiologi. Direkt nanoporering av enskilda celler är svårt på grund av den osäkerhet som är inneboende i lönsamheten efter poreringen.

Forskare vid Northwestern University har utvecklat en teknik för enskilda celler som ger hög lönsamhet och effektivitet.5 I deras tillvägagångssätt används en mikrofabricerad cantileveranordning, nanofountain probe (NFP). Den levererar molekyler till celler mer skonsamt än bulkmikroinjektion eller nanoporering. Forskarna har demonstrerat NFP-medierad elektroporation av enskilda HeLa-celler med en transfektionseffektivitet på bättre än 95 %, en livskraft på 92 % och kvalitativ doseringskontroll.

NFP:s utgör en förbättring jämfört med äldre transfektionstekniker med hjälp av sonder i atomkraftmikroskop. Tekniker baserade på atomkraftmikroskopi leder ofta till att cellerna tappar fästet eller spricker. NFP orsakar mindre skador på cellerna.