Elektroakupunktur dämpar oxidativ stress i lever och njurar hos bedövade råttor

13 -ORIGINALARTIKEL
METABOLISM

Elektroakupunktur dämpar oxidativ stress i lever och njurar hos sövda råttor1

Eletroakupuntura atenua o estresse oxidativo no fígado e no rim em ratos anestesiados

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

IFellow Master Degree, Department of Surgery, Postgraduate Program, UFC, Ceara, Brasilien. Tekniska förfaranden, insamling och tolkning av data. Artikeln är en del av ett examensarbete (AHS)
IIGraduate student, UFC, Ceara, Brasilien. Hjälpt till med tekniska procedurer, insamling av data
IIIPhD, docent, samordnare, forskarutbildningsprogram, avdelningen för kirurgi, UFC, Ceara, Brasilien. Kritisk granskning och tolkning av data
IVPhD, docent, avdelning för kirurgi, chef för LABCEX, UFC, Ceara, Brasilien. Handledare, utformning, design, studiens intellektuella och vetenskapliga innehåll, manuskriptskrivning, statistisk analys

Korrespondens

ABSTRACT

Syfte: Undersöka effekterna av en enda elektroakupunktursession (EA) vid akupunkturpunkterna Zusanli (ST-36) och Zhongwan (CV-12) kombinerat för att reglera oxidativ stress i lever och njurar hos bedövade råttor.
METODER: Arton friska råttor slumpmässigt fördelade på 3 grupper (n=6) sövdes intraperitonealt med ketamin (90mg kg-1 kroppsvikt) + xylazin (10mg/kg kroppsvikt): G-1: kontroll (bedövning), G-2: bedövning+EA10Hz och 10 mA, 10 Hz) applicerat på höger ST-36 och CV-12 akupunkturpunkter i 30 minuter. G-3 behandlades på samma sätt, med en tio gånger högre frekvens (100 Hz). G6PDH-aktivitet, malondialdehyd (MDA) och glutation (GSH) analyserades spektrofotometriskt.
RESULTAT: Koncentrationerna av MDA och GSH i levern ökade signifikant hos råttor som utsattes för EA 10Hz (p<0,01) och EA 100Hz (p<0,001), jämfört med kontroll G-1. G6GPH-aktiviteten i lever och njurar minskade signifikant hos G-2 (p<0,01) och G-3 (p<0,001) jämfört med G-1 hos EA100Hz-råttor. Ett liknande mönster fanns i njurarnas G6PDH-aktivitet hos EA10Hz-råttor.
KONKLUSION: En enda 30-minuters EA 10/100Hz-session ökar lipidperoxidationen och minskar samtidigt oxidativ stress i lever- och njurvävnader i en råttmodell.

Nyckelord: Akupunktur. Elektroakupunktur. Lipidperoxidation. Oxidativ stress. Råttor.

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de uma única sessão de eletroacupuntura (EA) aplicada nos acupontos Zusanli (E-36) e Zhongwan (RM-12) simultaneamente, na regulação do estresse oxidativo no fígado e rins em ratos anestesiados.
METODER: Arton friska råttor, slumpmässigt fördelade på tre grupper (n = 6), sövdes med ketamin (90 mg/kg kroppsvikt) + xylazin (10 mg/kg kroppsvikt): G-1: kontroll (anestesi), G-2: anestesi + EA10Hz och G-3: anestesi + EA100Hz. Råttorna i G-2-gruppen utsattes för EA (pulsade fyrkantiga vågor, 10 mA, 10 Hz) som applicerades på de högra akupunkturpunkterna ST-36 och VC-12 i 30 minuter. Hos råttorna i G-3-gruppen användes en 10 gånger högre frekvens (100 Hz). G6PDH-enzymets aktivitet och koncentrationerna av malondialdehyd (MDA) och glutation (GSH) kontrollerades med spektrofotometri.
RESULTAT: Leverkoncentrationerna av MDA och GSH ökade signifikant hos råttor som utsattes för AE med 10 Hz (p <0,01) och 100 Hz (p <0,001), jämfört med kontroll. G6GPH-aktiviteten minskade signifikant i G-2 (p <0,01) och G-3 (p <0,001) i lever och njure jämfört med G-1-gruppen hos råttor som behandlades med 100 Hz.
KONKLUSION: En enda 10/100Hz EA-session i 30 minuter ökar lipidperoxidationen och minskar samtidigt den oxidativa stressen i levern och njurarna hos friska råttor.

Deskriptorer: Akupunktur. Elektroakupunktur. Lipidperoxidation. Oxidativ stress. Råttor.

Introduktion

Manuell akupunktur (MA) är en av de viktigaste behandlingsformerna inom traditionell kinesisk medicin. Det innebär att man använder vassa, tunna nålar som förs in i kroppen på mycket specifika punkter (akupunkter). MA har använts i flera årtusenden i orientaliska länder och accepteras alltmer av behandlare och patienter i västvärlden1. Elektroakupunktur (EA) är en modifiering av denna teknik där små elektriska strömmar appliceras på nålar som tidigare har satts in i kroppen och verkar ge mer konsekvent reproducerbara resultat i många specifika kliniska och forskningsmiljöer2-4. EA applicerad på Zusanli (ST-36) akupunkt minskade lipidperoxidation i experimentella modeller av ischemi/reperfusion, t.ex. ryggmärg från råtta5, hjärna6 och blodserum7 och hjärtmuskel från gris8.

Chakrabarti et al.9 undersökte effekten av enkel, akut (7 pulser/sek., 0,75 volt) och kronisk (4 pulser/sek., 0,75 volt) elektroakupunkturbehandling på alternerande dagar under en period av 21 dagar på leverns funktioner hos råttor. Två ryggakupoints tillsammans med ST-36 användes. Efter kronisk behandling minskade det mikrosomala lipidperoxidationsvärdet i levern signifikant. Med tanke på att manuell stimulering av akupunkt ST-36 dessutom kan dämpa njurskador inducerade av sepsis10 är det möjligt att elektrisk stimulering av denna akupunkt kan förändra koncentrationerna av MDA, en indikator på cellmembranskador, i njurvävnad.

Fysiologiska processer regleras av enzymer. NADPH är den viktigaste intracellulära reduktanten och dess produktion är huvudsakligen beroende av glukos-6-fosfatdehydrogenas. Om G6PDH-aktiviteten hämmas minskar samtidigt NADPH-aktiviteten, ett koenzym som är viktigt för skyddet mot oxidativa skador. Både cellernas integritet och hela antioxidantsystemet är beroende av en tillräcklig tillförsel av NADPH11. Många artiklar har visat på effekterna av MA och EA på ST-36 akupunkt när det gäller att dämpa oxidativ stress vid olika experimentella sjukdomar5-9. Dessutom kan användningen av ketamin+xylazin, en anestesiblandning som ofta används i experimentella studier, inducera en viss grad av oxidativ stress hos ett friskt djur12-13.

Det har tidigare visats att stora mängder endogena opioidpeptider utsöndras från binjurarna när CV-12 akupunkturpunkterna stimuleras med akupunktur med 2 Hz14. När en högfrekvent EA (15 Hz) användes för att stimulera akupunkten CV-12 upptäcktes flera källor till endogena opioidpeptider15. Vi ville därför undersöka om EA som stimulerar både ST36- och CV-12-akupunkturpunkterna med två olika frekvenser, 10 Hz och 100 Hz, kan ändra MDA- och GSH-innehållet i lever och njurar och om det finns en skillnad i lipidperoxidation och oxidativ stress mellan 10 Hz och 100 Hz EA hos friska gnagare.

Metoder

Djurberedning

Manliga Wistar-råttor med en vikt på 280-400 g, som tillhandahölls av den medicinska fakultetens anläggning för uppfödning av smådjur (Federal University of Ceara), hölls under kontrollerade miljöförhållanden (24 °C _relativ luftfuktighet 40-60 %, 12 timmars alternerande ljus-mörkercykler, mat och vatten ad libitum). Motsvarigheten till människans högra akupunkturpunkter ST-36 och CV-12 valdes ut för nålning och elektrisk stimulering. Nomenklaturen för akupunkturpunkterna följer WHO:s nomenklatur16. ST-36 akupunkt är belägen 5 mm under fibulahuvudet under knäleden och 2 mm lateralt till skenbenets främre tuberkel. Punktering av ST-36 akupunkt stimulerar den laterala surala kutannerven, den kutana grenen av nervus saphenus och djupare, den djupa peroneusnerven17-18. Akupunkturpunkten CV-12 är belägen i främre mittlinjen av övre delen av buken, 20 mm nedanför synkondrosen i bröstbenet. Detta område är innerverat av den främre kutana grenen av den 8:e interkostalnerven18.

Material

Disposable nålar av rostfritt stål (0,20×30 mm, 0,5 cm, DongBang Acupuncture Inc., Chung Nam, Korea) användes. Elektrostimulatorn EL-608 köptes från NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brasilien.

Experimentella grupper

Djuren sövdes intraperitonealt med en nypreparerad blandning av ketamin (90 mg kg/kroppsvikt) och xylazin (10 mg kg/kroppsvikt). Råttor fördelades slumpmässigt i 3 lika stora grupper enligt följande:

* Grupp 1 (anestesi) – 6 råttor

* Grupp 2 (EA 10Hz) – 6 råttor

* Grupp 3 (EA 100Hz) – 6 råttor

Grupp 1 (kontroll) råttor sövdes enligt beskrivning. Sextio minuter senare öppnades råttornas buk och levern och de högra njurarna avlägsnades. Grupp 2 (EA10Hz) råttor sövdes enligt beskrivningen. Efter rutinmässig huddesinfektion med 75 % etanol steriliserade engångsnålar av rostfritt stål (0,25 mm × 30 mm) infördes vinkelrätt så djupt som 2-3 mm vid höger ST-36 och CV-12 akupunkturpunkter. Elektroder kopplades till båda nålarna och till en elektrostimulator (NKL EL-608); pulserande fyrkantsvågor, 10 Hz, 10 mA tillämpades i 30 minuter. Proverna samlades in 30 minuter senare. Grupp 3 (EA100Hz) råttor utsattes för EA som grupp 2. Dock användes en tio gånger högre frekvens (100 Hz).

Biokemiska bestämningar

De parametrar som bestämdes omfattade G6PDH-aktivitet, malondialdehyd (MDA) och glutationskoncentrationer (GSH). Vävnadsproverna frystes snabbt i flytande kväve och förvarades i glasrör vid -70º tills efterföljande beredning och analys av homogenater av lever och njurar. Lipidperoxidation analyserades genom att mäta malondialdehyd som TBA-reaktiva ämnen19. H3PO4 (1 %, 3 mL) och vattenhaltig TBA-lösning (0,6 %, 3 mL) tillsattes till 10 % homogenat (0,5 mL). Analysmediet skakades och värmdes på ett kokande vattenbad i 45 minuter. Efter avkylning tillsattes 4 mL n-butanol och blandningen skakades. Efter separation av n-butanolskiktet genom centrifugering vid 1200 g i 15 minuter bestämdes dess optiska densitet i en spektrofotometer (Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, numera Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) med 535 respektive 520 nm som absorptionsvåglängd. Skillnaden mellan resultaten av de två bestämningarna av den optiska densiteten togs som TBA-värde och mängden malondialdehyd (MDA) i testiklarna beräknades, jämfördes med MDA-standarder och uttrycktes som mikromol MDA per gram våt vävnad. GSH-nivåerna uppskattades med Sedlaks och Lindsays metod20 som bygger på reaktionen mellan tiolgrupper och 5-5-dithiobis-(2-nitrobenzoesyra) för att producera en förening som absorberar ljus vid 412 nm. Mängden GSH bestämdes utifrån en standardkurva som samtidigt erhölls under samma förhållanden med olika koncentrationer av GSH. G6PDH-aktiviteterna uppskattades med metoder som beskrivits tidigare21. Enzymaktiviteten avlästes spektrofotometriskt.

Dataanalys

Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) användes för beräkningar och statistisk analys. Alla resultat uttrycktes som medelvärde ±SD. Alla data testades för fördelning (Kolmorogov-Smirnov-test med Dallal-Wilkinson-Lilliefor P-värde). Envägs ANOVA eller Kruskal-Wallis-test, beroende på vad som krävdes, utfördes för att fastställa skillnader mellan grupper i MDA- och GSH-koncentrationer och G6PDH-aktivitet i lever- och njurvävnad. I post hoc-analysen (Tukey eller Dunn) ansågs ett sannolikhetsvärde på p<0,05 indikera statistisk signifikans.

Resultat

GSH-analys

GSH-koncentrationerna i levern ökade signifikant hos råttor som utsattes för EA 10Hz och EA 100Hz (p<0,001), jämfört med kontroll (figur 1). Liknande ökningar av GSH-koncentrationerna i njurarna inträffade i både EA10Hz- och EA100Hz-grupperna (figur 2). Dessutom ökade GSH-koncentrationerna i lever och njure signifikant hos EA100Hz-behandlade råttor jämfört med EA10Hz-gruppen.

MDA-analys

MDA-koncentrationerna i lever ökade signifikant hos råttor som utsattes för EA10Hz (p<0,01) och EA100Hz (p<0,001), jämfört med kontrollgruppen (figur 3). Liknande ökningar i njurarnas MDA-koncentrationer förekom i både EA10Hz- och EA100Hz-grupperna (figur 4). Njurarnas MDA-koncentrationer ökade signifikant i EA100Hz-gruppen jämfört med EA10Hz-gruppen.

G6PDH-analys

Liver G6GPH-aktivitet minskade signifikant i EA100Hz-grupperna (p<0,001) jämfört med kontrollgruppen (figur 5). Ett liknande mönster hittades i njurarnas G6PDH-aktivitet hos EA10Hz-råttor. Njurarnas G6PDH-aktivitet skiljde sig inte åt i båda grupperna (figur 6).

Diskussion

I vårt experiment inducerades den oxidativa stressen genom användning av ketamin, ett dissociativt anestesimedel, som ofta används antingen under veterinärmedicinska ingrepp eller för experimentella ändamål. Alva et al.12 visade att ketamin leder till ökade plasmatiska kväveoxidnivåer, inducerar metabolisk acidos och orsakar oxidativ skada, dock utan att nå hepatisk toxicitet.

Antiperoxidativa effekter av lågfrekvent EA har påvisats. Siu et al.6 elektrostimulerade akupunkturpunkterna GB-20, som ligger på den bakre delen av halsen, under occipitalbenet, i depressionen mellan sternocleidomastoidmuskeln och trapeziusmuskeln och ST-36, med hjälp av flera tillämpningar före cerebral ischemi och drog slutsatsen att 2 Hz EA delvis kunde reglera lipidperoxidationen vid cerebral ischemi. GB-20 och ST-36 hade en liknande positiv effekt6. I vår studie inducerade användningen av EA en signifikant ökning av MDA-koncentrationen i levern (figur 3) och njurarna (figur 4) i EA10Hz- och EA100Hz-grupperna. Ytterligare ökning av lipidperoxidation inträffade i EA100Hz-gruppen jämfört med EA10Hz-råttor. Detta tyder på att njurarna är mer mottagliga för lipidperoxidation än levern. Det verkar som om användningen av elektrisk stimulering som utnyttjar höga frekvenser i en enda session ökar peroxidationen av lipider i denna råttmodell.

Yu et al.22 utvärderade betydelsen av nålstimulering av fyra olika akupunkturpunkter: GB-34 (Yanglingquan), LR-3 (Taichong), ST-36 (Zusanli) och SP-10 (Xuehai) på regleringen av oxidativ stress i det nigrostriatala systemet i den 6-hydroxydopaminskadade råttan och drog slutsatsen att stimulering av akupunktur förhindrade minskningen av GSH-nivån samt ökningen av MDA-nivån.

Som vi studerade effekterna av en enda elektroakupunktursession medan vi i Yu et al.22 utvärderade effekterna av den klassiska akupunkturbehandlingen, som utfördes två gånger om dagen i 14 dagar. Vi tror att användningen av elektrisk stimulering i en enda session kan vara ansvarig för ökningen av MDA-nivåerna. Å andra sidan inducerade EA som användes i en enda session en signifikant ökning av GSH-koncentrationen i både lever- (figur 1) och njurvävnad (figur 2). Den skyddande effekten av EA är större vid högre frekvenser, vilket visas av den ökade koncentrationen av GSH i njurarna hos EA100Hz-råttor, jämfört med EA10Hz-djur.

G6PDH spelar en mycket viktig roll i cellens svar på oxidativ stress. Tills nyligen fanns det en allmän uppfattning att detta enzyms betydelse var begränsad till mänskliga erytrocyter som saknar andra NADPH-producerande vägar23. Nya observationer har visat att G6PDH spelar en skyddande roll mot reaktiva syrearter i eukaryota celler som har alternativa vägar för produktion av NADPH24. I den här studien minskade G6PDH-aktiviteten signifikant i levern hos EA10Hz- och EA100Hz-grupperna. En liknande minskning av aktiviteten sågs i njurarna hos EA10Hz-råttor. Koncentrationerna av GSH i njurarna ökade hos EA100Hz-råttor samtidigt som en samtidig minskning av G6PDH påvisades i samma grupp.

Yu et al.25 har visat att G6PDH-aktiveringen är omvänt korrelerad med de intracellulära GSH-nivåerna med hjälp av cellsuspensionskulturer av Taxus chinensis. Det är möjligt att djurceller skulle kunna ha ett liknande beteende.

Vad gäller styrkor och svagheter med denna studie i förhållande till andra finns det ingen publicerad studie som direkt kan jämföras med den aktuella forskningen. Trots att peroxidativa effekter av EA påvisades här, i motsats till andra studier6, användes inte 10 Hz elektrostimulering av andra forskare. I publicerade studier användes lågfrekvent EA (2 Hz), i flera sessioner. I vår studie användes en enda session. Å andra sidan tyder minskningen av G6PDH-aktiviteten i levern och njurarna hos råttor som behandlades med 100 Hz respektive 10 Hz, tillsammans med en samtidig ökning av GSH-nivåerna, efter en enda EA-session, på att högre frekvenser skulle kunna inducera ett bättre skydd mot oxidativ stress. De inblandade mekanismerna är ännu inte klarlagda. Ytterligare studier kan kasta nytt ljus över de skyddande effekterna av elektroakupunktur.

Slutsats

De insamlade uppgifterna stöder hypotesen att en enda 30-minuters EA 10/100 Hz-session ökar lipidperoxidationen och samtidigt minskar oxidativ stress genom att öka GSH-nivåerna i lever- och njurvävnader i en råttmodell.

1. Campbell A. Akupunkturens ursprung. Acupunct Med. 2002;20(2-3):141

6. Siu FK, Lo SC, Leung MC. Effektivitet av multipel elektroakupunktur före ischemi för att dämpa lipidperoxidation inducerad av cerebral ischemi hos vuxna råttor. Life Sci. 2004;75(11):1323-32.

8. Wang XR, Xiao J, Sun DJ. Myokardiella skyddseffekter av elektroakupunktur och hypotermi på grishjärtan efter ischemi/reperfusion. Acupunct Electrother Res. 2003;28(3-4):193-200.

12. Alva N, Palomeque J, Carbonell T. Nitric oxide induced by ketamine/xylazine anesthesia maintains hepatic blood flow during hypothermia. Kväveoxid. 2006;15(1):64-9.

14. Lin JG, Chang SL, Cheng JT. Frisättning av beta-endorfin från binjuren för att sänka plasmaglukos genom elektroakupunktur vid Zhongwan akupunkt hos råttor. Neurosci Lett. 2002;326(1):17-20.

15. Lin JG, Chen WC, Hsieh CL, Tsai CC, Cheng YW, Cheng JT, Chang SL. Flera källor till endogen opioidpeptid som är inblandade i det hypoglykemiska svaret på 15 Hz elektroakupunktur vid Zhongwan-akupunkten hos råttor. Neurosci Lett. 2004;366(1):39-42.

16. Världshälsoorganisationen (WHO). Standardakupunkturnomenklatur: en kort förklaring av 361 klassiska akupunkturpunkter och deras flerspråkiga jämförande lista. 2ed. WHO:s regionalkontor för västra Stilla havet; 1993.

23. Xu Y, Osborne BW, Stanton RC. Diabetes orsakar hämning av glukos-6-fosfatdehydrogenas via aktivering av PKA, vilket bidrar till oxidativ stress i råttans njurcortex. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;289(5):F1040-7.

24. Salvemini F, Franzé A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. Förbättrade glutationnivåer och oxidoresistens medierad av ökat uttryck av glukos-6-fosfatdehydrogenas. J Biol Chem. 1999;274(5):2750-7.

25. Yu LJ, Lan, WZ, Chen C, Yang Y. Glutathionnivåerna kontrollerar glukos-6-fosfatdehydrogenasaktiviteten under elicitorinducerad oxidativ stress i cellsuspensionskulturer av Taxus chinensis. Plant Sci. 2004;167:329-35.