Echovirus 4 i samband med hand-, fot- och munsjukdomar

VIROLOGI

Echovirus 4 i samband med hand-, fot- och munsjukdomar

Echovirus 4 i samband med hand-, fot- och munsjukdomar

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Laboratorium för enterovirus, Adolfo Lutz-institutet, São Paulo, SP, Brasilien

Svar till

SAMMANFATTNING

Hand-, fot- och munsjuka (HFMD) är en smittsam enterovirusinfektion som främst drabbar barn och som kännetecknas av blåsor i form av palmeoplantära eruptioner och erosiv stomatit. Echovirus 4 (EV-4) har ofta förknippats med aseptisk meningit. Sambandet mellan HFMD och EV-4 har inte rapporterats tidigare. Två prover från ett barn på 14 månader som uppvisade mild feber, sår i munnen, utslag med blåsor på handflator och fotsulor skickades till laboratoriet för enteriska virus vid Adolfo Lutz-institutet. De kliniska proverna inokulerades i tre olika cellinjer, och de som uppvisade cytopatisk effekt (CPE) genomgick indirekta immunofluorescensanalyser (IFA) och RT-PCR i ett steg. Agarosgelelektrofores från RT-PCR-produkten visade en produkt med 437 bp, vilket är karakteristiskt för Enterovirusgruppen. Echovirus 4 identifierades med hjälp av IFA. Även om HFMD är en virusinfektion som huvudsakligen är förknippad med Enterovirus 71 (HEV-71) och Coxsackievirus A16 (CV-A16), visar våra resultat på en mångfald av serotyper som är relaterade till HFMD och understryker vikten av epidemiologisk övervakning av denna sjukdom och dess komplikationer.

Nyckelord:

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupções palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) är ofta förknippat med hjärnhinneinflammation. Att EV-4 är associerad med DMPB har inte beskrivits tidigare. Två prover från ett 14 månader gammalt barn med feber, halssekret och utslag på handflator och fötter skickades till laboratoriet för enteriska virus vid Instituto Adolfo Lutz. Proverna inokulerades i tre olika cellinjer; de som uppvisade cytopatisk effekt (CPE) genomgick indirekt immunofluorescensanalys (IFI) och RT-PCR i ett steg. Agarosgelelektrofores som utfördes med PCR-produkten visade en produkt på 437pb, vilket är karakteristiskt för Enterovirusgruppen. Serotypen EV-4 identifierades genom IFI. Även om DMPB är en virusinfektion som huvudsakligen är förknippad med Enterovirus 71 (HEV-71) och Coxsackievirus A16 (CV-A16), understryker våra resultat behovet av epidemiologiska och laboratorieundersökningar som riktar in sig på EV-4 som orsak till DMPB.

INLEDNING

Hand-, fot- och munsjukdomar (HFMD) är en vanlig sjukdom som drabbar spädbarn och barn under 10 år och kännetecknas av feber, sår i munnen och utslag med blåsor. HFMD börjar med mild feber, dålig aptit, illamående och ofta halsont. En eller två dagar senare observeras feber och utveckling av sår i munnen. Små röda fläckar med blåsor som blir sår förekommer ofta. De är vanligen belägna på tungan, tandköttet och på insidan av kinderna. Hudutslaget utvecklas under 1-2 dagar med platta eller upphöjda röda fläckar och en del med blåsor. Utslagen kliar inte och är vanligen lokaliserade på handflatorna och fotsulorna. Det förekommer även på skinkorna. Även om vissa personer med HFMD kan ha endast utslag eller munsår4.

Smitta sker från person till person genom direktkontakt med näs- och halsutgjutning eller via fekal oral väg. HFMD överförs inte till eller från husdjur eller andra djur. Enskilda fall av HFMD förekommer över hela världen, oftare under sommaren och tidig höst4. Vertikal spridning från mor till foster förekommer också, men i de fall som löser sig utan långsiktiga komplikationer kan infektion under första trimestern leda till spontan abort eller intrauterin tillväxthämning. Andra komplikationer har rapporterats, bland annat myokardit, meningoencefalit, lungödem och till och med dödsfall16.

Den första HFMD-rapporten gjordes av ROBINSON & RHODES 195812. De rapporterade ett exanthem med tillhörande feber och orala lesioner som noterades hos över 60 personer i juni och juli 1957 i Toronto, Kanada. Coxsackievirus A16 (CV-A16) isolerades från två tredjedelar av 27 undersökta avföringsprover. Nästa rapporterade epidemi av Coxsackievirus inträffade i Birmingham, England, sommaren 1960 och beskrevs av ALSOP et al.2 som noterade vesikulära lesioner på händer och fötter med orofaryngeala lesioner och som gav utbrottet namnet hand-, fot- och munsjukdomen16.

HFMD orsakas av enterovirus, som tillhör Picornavirus-familjen (enkelsträngat RNA, ej omslutet) och är oftast associerad med CV-A16 eller Enterovirus 71 (HEV-71). Sporadiska fall med CV-A4 till CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 till CV-B3 och CV-B5 har också rapporterats. Infektionerna är vanligtvis sporadiska men epidemier förekommer regelbundet. Initial virusinfektion sker i buccalmucosa och ilealmucosa och följs av spridning till regionala lymfkörtlar inom 24 timmar. Viremi följer snabbt och viruset sprids till munslemhinnor och hud. Omkring den sjunde dagen efter infektionen kan antikroppsnivåerna i serum börja öka 6,8.

Patienter och metoder

Prover: Under juli 2003 inträffade ett utbrott av HFMD på ett daghem i São Paulo City, och två avföringsprov från ett 14 månader gammalt manligt barn som misstänktes för sjukdomen skickades till laboratoriet för enteriska virus vid Adolfo Lutz-institutet. Han uppvisade feber, sår i munnen, sjukdomskänsla, dålig aptit och utslag på handflator och fotsulor. Andra åtta barn från samma center, i åldrarna 10 månader till tre år, uppvisade liknande symtom. HFMD diagnostiserades av andra medicinska centra (personlig kommunikation). Det var omöjligt att samla in parade serumprover för att fortsätta de serologiska testerna till antikroppstitrering.

Viral isolering och identifiering: Proverna som samlades in inom sex dagar efter varvet klargjordes under centrifugering vid 10 000 x g/60 minuter, vid 4 ºC; antibiotika (streptomycin och penicillin ) tillsattes och supernatanten förvarades vid -70 ºC fram till inokulering (0,1 och 0,2 mL/rör) på tre olika cellinjer: RD (humant rhabdomyosarkom), HEp 2 (epidermalt humant larynxkarcinom) och Vero (grön aknjure) som innehåller minimalt essentiellt medium (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate respektive 199 medium). Därefter förvarades rören vid 35-37 ºC. Kulturerna observerades i inverterat mikroskop varje dag för att visualisera cytopatisk effekt (CPE). Successiva passeringar av det inokulerade materialet gjordes tills det uppstod eller inte uppstod en karakteristisk CPE för HEV-infektion7.

Indirekt immunofluorescensanalys – IFA: När cellkulturen uppvisade minst 75 % CPE skrapades den av röret och cellsuspensionen prickades på ett glasobjektsglas, som lufttorkades och fixerades med aceton. Därefter gjordes en indirekt immunofluorescensanalys (IFA) med hjälp av specifika monoklonala antikroppar som finns kommersiellt tillgängliga (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) för genus, grupp och HEV-serotyper. Objektglasbrunnarna undersöktes i ett epifluorescensmikroskop3.

RT-PCR: Virus-RNA extraherades från isolerat virus med Trizol® LS (Invitrogen, kat. 1296-010) och kloroform enligt tillverkarens anvisningar. Efter centrifugering vid 12 000 xg separerades den vattenhaltiga fasen och fällningen gjordes med isopropylalkohol. RNA-pelletsen tvättades med 75 % etanol. I slutet av förfarandet torkades RNA kort och resuspenderades med Milli-Q-vatten. RNAsin tillsattes och RNA förvarades vid -70 ºC. cDNA syntetiserades med hjälp av det extraherade RNA:t och blandningen: 50 mM MgCl2; 10x PCR-buffert; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNA-polymeras; 40 U/µL RNAsin och Milli-Q vatten. Amplifikationsreaktionerna utfördes i Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer termocyler med följande programmering: (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 cykler (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). PCR-produkterna separerades med 1,5 % agarosgel, färgades med etidiumbromid och visualiserades under UV-ljus. Primerna som var riktade mot den 5′-icke-translaterade regionen amplifierade en produkt på 437bp13.

RESULTAT

CPE som tyder på HEV: rundning, krympning, kärnpyknos, refraktilitet och celldegeneration var känsliga för RD- och Vero-celler. Tiden för att rapportera positiva kulturer var cirka 4-7 dagar.

En ljus äppelgrön fluorescens i cellkärnan och/eller cytoplasma kunde observeras i epifluorescensmikroskopet, vid 400x, vilket indikerar en positiv reaktion på echovirus 4 serotyp. IFA var negativ för de andra monoklonala antikropparna.

RT-PCR användes för att bekräfta HEV-släktet. Agarosgelelektrofores visade en produkt med 437 bp, vilket identifierar HEV (fig. 1).

DISKUSSION

Det etiologiska agens som identifierades i denna studie är HEV som skiljer sig från de andra som tidigare relaterats till HFMD. Detta syndrom har ofta förknippats med CV-A16 och HEV-71, medan inga epidemiologiska uppgifter om EV-4 i samband med HFMD har hittats i litteraturen.

Det utbrott av HFMD som inträffade i Malaysia (1997) var förknippat med EV-1, CV-A9 och HEV-711. HFMD orsakad av HEV-71 har förknippats med dödliga fall av hjärninflammation under utbrotten i Malaysia (1997) och Taiwan (1998)17. EV-7 hittades under den senare delen av 2000, utöver CV-A16 och EV-7, som ett etiologiskt agens för HFMD5. I Brasilien rapporterade MOREIRA et al. (1995) om en epidemisk exantemisk sjukdom i samband med coxsackievirus B3 (CV-B3)10. Det finns ingen rapport om sambandet mellan EV-4 och HFMD i Brasilien, kanske på grund av bristen på kliniska misstankar.

EV-4 är allmänt relaterat till aseptisk meningit, encefalit, förlamning, Güillan-Barré-syndromet, exantem och luftvägssjukdomar och har påträffats runt om i världen, främst som orsak till utbrott av aseptisk meningit: På Kuba 1972-1999, i Kapstaden i Sydafrika 1981-1989, i april 1997 i regioner i Israel och den palestinska myndigheten, i Spanien 1988-2003, hösten 1982 i Polen och i Vellore och omgivande områden i Indien 20028,9,11,14,15,18.

Typiskt sett är enterovirusinfektioner antingen asymtomatiska eller leder till mild sjukdom. Det rekommenderas därför att man samlar in serumprover för att genomföra antikroppstitrering med mikroneutraliseringsteknik, vilket skulle vara ytterligare en parameter för att bekräfta att det isolerade viruset är det som är ansvarigt för sjukdomen. I samband med isolering av avföringen bekräftar en fyrfaldig ökning av serumtitreringen (serokonversion) den akuta infektionen. Tyvärr var det inte möjligt att få tag på serumprover i denna studie.

Trots detta diagnostiserades alla övriga åtta barn som HFMD av medicinska centra, baserat på de kliniska tecknen.

Och även om detta resultat kanske inte räcker för att påstå att EV-4 var en sjukdomsorsak, verkade det rimligt att dra slutsatsen att signalerna och de uppenbara kliniska manifestationerna bekräftar hypotesen att viruset inte är ett övergående virus.

Det är viktigt att betona att CV-A16 och HEV-71, som är kända som huvudorsaken till HFMD, vanligtvis producerar CPE i RD-, HEp2- och Vero-cellkulturer; men i denna studie identifierades de inte.

Vårt arbete visar att EV-4 är en orsak till HFMD och antyder möjligheten att andra HEV-serotyper eventuellt kan vara relaterade till HFMD-fall. Denna fallrapport understryker behovet av att intensifiera epidemiologiska och laboratorieundersökningar av denna serotyp och övervakningen av andra HEV-serotyper som är inblandade i HFMD måste ökas i Brasilien.

ÅTERKÄNNANDE

Vi är särskilt tacksamma mot Dr. Luís Florêncio Salles Gomes för hans förslag och kritik av denna artikel.

1. ABUBAKAR, S.; CHEE, H.Y.; SHAFEE, N.; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Molekylär detektion av enterovirus från ett utbrott av hand-, fot- och munsjukdomar i Malaysia 1997. Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. ALSOP, J.; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – ”Hand-foot-and-mouth disease” i Birmingham 1959. Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D.; SIMONET, S.; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Identifiering av enterovirus genom indirekt immunofluorescens med monoklonala antikroppar. Clin. diagn. Virol. 3: 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (finns i http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Tillgänglig i maj 2005.

5. CHUA, B.H.; McMINN, P.C.; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – Jämförelse av de fullständiga nukleotidsekvenserna av echovirus 7 stam UMMC och prototypstammen (Wallace) visar att det finns en betydande genetisk drift över tiden. J. gen. Virol., 82: 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Hand-, fot- och munsjukdomar. EMedicine Journal, 2002. (tillgänglig i http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Tillgänglig i maj 2005.

7. GRANDIEN, M.; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Enterovirus and reovirus. in: LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., red. Diagnostiska förfaranden för virus- och rickettsiasjukdomar. 6. ed. Washington, American Public Health Association, 1989. s. 513-578.

8. HANDSHER, R.; SHULMAN, L.M.; ABRAMOVITZ, B. et al. – En ny variant av echovirus 4 i samband med ett stort utbrott av aseptisk meningit. J. clin. Virol. 13: 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – Laboratorieövervakning av viral meningit genom undersökning av cerebrospinalvätska i Kapstaden 1981-9. Epidem. Infect. 111: 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C.; CASTRIGNANO, S.B.; CARMONA, R.C. et al. – En epidemi av exantemisk sjukdom i samband med infektion med coxsackievirus B3 på ett daghem. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37: 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K.; GRUDZINSKA, B.; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – Sena följder av epidemisk viral meningit. Wiad. lek. 42: 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R.; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Rapport om ett utbrott av febril sjukdom med svalgskador och exantem: Toronto, sommaren 1957; isolering av Coxsackie-virus av grupp A. Canad. med. Ass. J., 79: 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Enzymatisk RNA-amplifiering av enterovirus. J. clin. Microbiol. 28: 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L.; MAS, P.; GOYENECHEA, A. et al. – Första epidemin av meningit med echovirus 16 på Kuba. Emerg. infect. Dis., 7: 887-889, 2001.

15. SATHISH, N.; SCOTT, J.X.; SHAJI, R.V. et al. – Ett utbrott av echovirusmeningit hos barn. Indian Pediat. 41: 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Virala exanthemer. Derm. Online J., 9: 4, 2003.

17. SHIMIZU, H.; UTAMA, A.; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 från dödliga och icke-dödliga fall av hand-, fot- och munsjukeepidemier i Malaysia, Japan och Taiwan 1997-1998. Jap. J. infect. Dis., 52: 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (tillgänglig i http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Tillgänglig i maj 2005

.