Camptothecin

3.1 Introduktion

Camptothecin (CPT) är en monoterpenindolalkaloid som först isolerades från Camptotheca acuminata av Monroe Wall och Mansukh Wani vid USDA:s avdelning för växtintroduktion i mitten av 1958 (Wall et al., 1966). C. acuminata är ett träd som är inhemskt i Kina och dess bark används i traditionell kinesisk medicin sedan urminnes tider. Wall och Wani (1996), som är medupptäckare av CPT och taxol, har gjort en noggrann genomgång av vad som hände vid upptäckten av CPT. Senare under 1950-talet och fram till slutet av 1960-talet fick CPT:s potenta anticancerverksamhet forskare att undersöka den totala kemiska syntesen och validera dess potential genom prekliniska och kliniska studier (Schultz, 1973). CPT:s effektivitet undersöktes i USA genom kliniska fas I- (Gottlieb och Luce, 1972; Muggia et al., 1972) och fas II-studier (Moertel et al., 1972). Klinisk användning av CPT var uppenbar i Kina för behandling av mag- och blåscancer och vissa typer av leukemi, ofta i kombination med kortikosteroider (Pettit, 1976). De tidiga studierna visade att den vattenlösliga karboxylatformen av CPT (CPT-natriumsalt) visade vissa positiva resultat mot hals- eller blåscancer i Kina (Xu, 1980). Resultaten av kliniska prövningar från USA med användning av CPT:s karboxylatform visade sig dock inte vara lika lovande som cancerläkemedel. Denna inkonsekvens kan tillskrivas det faktum att de amerikanska kliniska försöken endast omfattade patienter som redan hade visat resistens mot annan behandling. Bristen på konsekvent effektivitet hos CPT:s karboxylatform i kliniska prövningar fick dock forskarna att fokusera på CPT-laktonformen för ytterligare förbättrade läkemedel. De kliniska försöken med CPT avbröts dock i huvudsak på 1970-talet på grund av oförmågan att lösa CPT:s vattenolösliga egenskap i laktonformen, låga svarsfrekvenser och hög toxicitet såsom myelosuppression, gastrointestinala toxiciteter och hemorragisk cystit (Horwitz, 1975; Rozencweig et al., 1976)

Och även om de kliniska försöken med CPT avslutades på 1970-talet, fortsatte studierna med avseende på dess verkningsmekanism under senare år. Det är doktorerna Marshall och Susan Horwitz vid Albert Einstein College of Medicine, som tillsammans med andra, gjorde de första upptäckterna om CPT:s verkningsmekanism. Deras studier visade att CPT hämmar DNA- och RNA-syntesen (inklusive ribosomalt RNA) och inducerar DNA-skador (Horwitz et al., 1971; Kessel, 1971; Abelson och Penman, 1972; Wu et al., 1971; Horwitz och Horwitz, 1973). Dessa forskare observerade att CPT är mest potent under cellcykelns S-fas och förutspådde att ingreppet under DNA-replikationen kan spela en roll för CPT-inducerad celldöd. Senare studier visade att CPT stoppade cellcykeln i både S- och G2-fasen, vilket är orsakerna till CPT:s cytotoxicitet (Tsao et al., 1992; Goldwasser et al., 1996). Under det tidiga 1980-talet undersöktes ett antal orelaterade DNA-skadande ämnen kliniskt för att behandla cancer och bakterieinfektioner. Studier avslöjade två olika klasser av DNA-skadliga läkemedel såsom kinolonantibiotika (cinoxacin, nalidixinsyra och ciprofloxacin) och podofyllotoxinderivat (etoposid och teniposid) som visade sig vara DNA-skadliga. Båda läkemedelsklasserna hade samma verkningsmekanism, dvs. hämning av topoisomeras II (Top2), ett enzym som är aktivt under S-fasen och som hjälper till med DNA-replikationsfenomenet (Froelich-Ammon och Osheroff, 1995). Dr Leroy F. Lius team vid John Hopkins, i samarbete med Smith Kline & French Laboratories i Philadelphia, testade om CPT också har en liknande aktivitet för att framkalla celldöd. Till deras förvåning misslyckades 125 µM CPT med att hämma Top2-beroende DNA-klyvning. När de testade andra enzymer som är associerade med DNA-replikation observerade de dock en potent och dosberoende induktion av DNA-skador i närvaro av topoisomeras I (Top1) (Hsiang et al., 1985). Top1-ortologer finns i alla eukaryoter och verkar vara ett essentiellt enzym under utvecklingen hos en mängd olika djur. Att slå ut Top1 under tidiga utvecklingsstadier är till exempel dödligt för både Mus musculus (Morham et al., 1996) och Drosophila melanogaster (Zhang et al., 2000a,b). DNA Top1 är det enzym som ansvarar för att slappna av supercoiled DNA under processen för DNA-replikation och transkription. Top1 klyver först det superspolade DNA:t för att införa en enkelsträngad brytning, eller nick, i DNA:t. Top1 binder sedan kovalent till den nickade 3′-änden av DNA:t och låter den 5′-nickade strängen rotera runt den intakta strängen på ett kontrollerat sätt. Efter rotationen religiösiserar Top1 den nickade strängen (Koster et al., 2005). Denna bildning av Top1-DNA-komplex under DNA-replikation kallas vanligen ”Top1 covalent complex”, på grund av den kovalenta bindningen mellan Top1 och den nicked strängen (Pommier, 2006). CPT och CPT-analoger kräver en hämning av Top1-aktiviteten (Eng et al., 1988; Nitiss och Wang, 1988), vilket leder till celldöd. I cellen integrerar CPT sig själv i det kovalenta komplexet Top1/DNA och bildar ett ternärt komplex. Därför är både Top1 och DNA nödvändiga för aktiviteten, och CPT uppvisar inte bindningsförmåga i avsaknad av någon av de båda (Leteurtre et al., 1993). CPT binder till både Top1-enzymet och den intakta DNA-strängen genom vätebindning och förhindrar både religering av det nicked DNA och dissociering av Top1 från DNA. Under replikationen fungerar detta CPT-ternära komplex som en vägspärr för replikationsgaffeln. Kollisionen mellan det ternära komplexet och replikationsgaffeln orsakar skjuvspänning på intakt DNA-sträng, vilket leder till brott och celldöd. Det kända målet för CPT och dess analoger är Top1-DNA-komplexet. Som nämnts ovan har det dock visats att CPT även påverkar protein-, RNA- och DNA-syntesen, vilket tyder på att CPT kan ha andra cellulära måltavlor. CPT:s hämmande aktivitet bekräftas ytterligare när jästceller med borttagen Top1 blir funktionellt immuna mot CPT och dess analoger, och däggdjurs- eller mänskliga cancerceller blir resistenta mot CPT:er när Top1 är muterad (Gongora et al., 2011; Urasaki et al., 2001; Benedetti et al., 1993; Chang et al., 2002; Arakawa et al., 2013; Jensen et al., 2016). Övexpression av en muterad Top1 (Yanase et al., 1999) resulterar i ökad aktivitet av Top1-förstärkt CPT-känslighet (Wu et al., 2014). Det mest omfattande studerade och dokumenterade verkningssättet för CPT och dess analoger är hämning av DNA. I denna översikt diskuteras dock olika andra cellulära och molekylära mål för CPT som också är ansvariga för anticanceraktivitet.