Caco-2 Permeability Assay

Frågor och svar om Caco-2 permeabilitet

Ge en översikt över Cyprotex Caco-2 Permeability assay.

Caco-2-celler används ofta som en in vitro-modell för att förutsäga absorption av läkemedel från människor. Caco-2-cellinjen härstammar från ett humant kolorektalcancer, och när cellerna odlas differentieras de spontant till monolager av polariserade enterocyter.

Cellerna sås ut på multiwell-insert-plattor och bildar ett sammanflytande monolager under 20 dagar före försöket. På dag 20 tillsätts testämnet till den apikala sidan av membranet och flödet av ämnet genom monolaget övervakas under en två timmar lång tidsperiod. För att studera läkemedelsutflödet är det också nödvändigt att undersöka transporten av substansen från det basolaterala kompartmentet till det apikala kompartmentet.

Permeabilitetskoefficienten (Papp) beräknas utifrån följande ekvation:

Varvid dQ/dt är läkemedlets permeationshastighet över cellerna, C0 är givarkoncentrationen vid tidpunkt noll och A är arean av cellmonolaget.

Hur tolkar jag data från Caco-2 permeabilitetsanalysen?

Det finns flera sätt att använda data från Caco-2 permeabilitetsanalysen. För det första kan föreningarna rangordnas efter deras Papp-värden. Två referenssubstanser, atenolol (passiv paracellulär transport) och propranolol (passiv transcellulär transport) screenas tillsammans med testsubstanserna. Atenolol och propranolol har en känd absorption hos människor på 50 % respektive 90 %2,3 och kan användas som markörer för att rangordna testföreningar. För det andra kan data användas tillsammans med andra in vitro-parametrar för att förutsäga den orala farmakokinetiken för en substans in vivo med hjälp av simuleringsprogrammet Cloe PK. För det tredje kan Caco-2-data användas för att förutsäga blod-hjärnbarriärens (BBB) permeabilitet (figur 3).

Figur 3
Korrelation mellan Caco-2 härledd Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) och in situ BBB-permeationshastighet, logPS (permeabilitetsyta-yta produkt). Läkemedel som är kända för att permeera BBB (koffein, imipramin, progesteron) har logPS >-2,0 (grönt skuggat område), medan läkemedel som är kända för att inte korsa BBB (aldosteron, hydrokortison, cimetidin) har en logPS ≤-3,5 (rosa skuggat område).

En regressionslinje visas som visar en tydlig korrelation mellan Pactive och logPS för föreningar som inte är föremål för betydande nivåer av utflödesaktivitet i Caco-2-cellerna, dvs, för föreningar med en Pactive på < 5 × 10 -6 cm/s. Med hjälp av denna korrelation kan Cyprotex Caco-2-analys användas för att utvärdera BBB-potentialen för föreningar med Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

Vilket är förhållandet mellan Caco-2 permeabilitet och mänsklig tarmabsorption?

Förhållandet mellan Caco-2 permeabilitet (med användning av HBSS-buffertar med pH 7,4 i både det apikala och basolaterala kompartmentet) och mänsklig tarmabsorption visas i figur 4. Detta samband är typiskt för de samband som observerats i litteraturen för dessa två parametrar4. Det är viktigt att notera att denna plott påverkas av noggrannheten hos uppgifterna om tarmabsorptionen. De värden för tarmabsorptionen som används i denna graf är hämtade från Zhao et al. 20012. I detta dokument har den mänskliga tarmabsorptionen hämtats från olika källor och varierar avsevärt i kvalitet. Flera föreningar är också kända för att uppvisa dosberoende absorption (visas med felstaplar i grafen).

Figur 4
Samband mellan Caco-2 permeabilitet och % humant intestinal absorption.

Vilka skillnader finns det mellan PAMPA- och Caco-2 permeabilitetsanalysen?

Caco-2 permeabilitetsanalysen anses vara mer representativ för mänsklig absorption in vivo än PAMPA (parallell artificiell membranpermeabilitetsanalys). PAMPA ger endast ett mått på passiv diffusion medan Caco-2-modellen ger en bättre förutsägelse av absorptionen hos människor för föreningar som uppvisar aktivt upptag eller utflöde eller passerar genom membranen via den paracellulära vägen. Informationen från båda testerna som används tillsammans kan vara värdefull för att identifiera grundorsaken till dålig absorption.

Hur mäter jag läkemedelsutflödet?

En dubbelriktad Caco-2 permeabilitetsanalys utförs där transporten av substansen mäts i den apikala till basolaterala riktningen samt i den basolaterala till apikala riktningen. Resultatet rapporteras vanligtvis som ett utflödesförhållande, dvs. Papp(B-A)/Papp(A-B). Om utflödesförhållandet är större än två tyder det på att det sker ett utflöde av läkemedel. Talinolol, ett känt P-gp-substrat, screenas som en kontrollförening för att bekräfta att cellerna uttrycker funktionella utflödestransportproteiner.

Hur vet man om cellerna har bildat ett sammanflytande monolager?

Mätning av elektriskt motstånd i kransepitelet (TEER) används för att avgöra om det bildas en tight-junction mellan cellerna. Dessutom saminkuberas lucifergult, en markör för membranintegritet, med testämnet i början av experimentet. Om lucifergulans Papp överstiger 1,0 × 10 -6 cm/s i en brunn, men det härledda Papp-resultatet för testsubstansen eller kontrollsubstansen i den brunnen kvalitativt liknar det som bestämts i de återstående replikbrunnarna (inom lucifergulans tröskelvärde), kan cellmonolagret anses acceptabelt, baserat på den ansvarige vetenskapsmannens vetenskapliga bedömning. Om så inte är fallet utesluts resultatet från det påverkade monolaget och ett n=1-resultat rapporteras, eller så kan substansen testas på nytt. Om båda replikaten är påverkade ska substansen testas på nytt. Om båda lucifergul Papp-värdena misslyckas för samma förening vid två separata tillfällen antas det att föreningen uppvisar antingen cytotoxiska effekter mot Caco-2-cellerna eller inneboende fluorescens.

Hur och varför beräknas den procentuella återvinningen?

Den procentuella återvinningen kan vara användbar vid tolkningen av Caco-2-data. Om återvinningen är mycket låg kan det tyda på problem med dålig löslighet, bindning av substansen till plattan, metabolism av Caco-2-cellerna eller ackumulering av substansen i cellmonolaget.