Burkholderia cepacia complex-infektion på en enhet för cystisk fibros hos vuxna i Madrid | Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Introduktion

Burkholderia cepacia complex (BCC) har framträtt som en viktig patogen hos cystisk fibros-patienter på grund av risken för cepacia-syndrom (en dödlig nekrotiserande pneumoni med bakteriemi), organismens medfödda multiresistens mot antibiotika och att bakteriestammar kan överföras mellan patienter genom social kontakt.1 Nära och långvarig kontakt mellan CF-patienter och delning av nebulisatorer underlättar förvärv och överföring av BCC.2,3 Det är bevisat att förvärv av BCC-bakterier är förknippat med sjukhusvistelse och korskontaminering genom social kontakt CF.

Taxonomin för släktet Burkholderia har genomgått flera stora revideringar under de senaste decennierna. I mitten av 1990-talet visades ”B. cepacia”-stammar tillhöra minst fem olika arter som tillsammans kallades B. cepacia-komplexet4 . Ytterligare taxonomiska analyser visade att det fanns ännu fler arter inom BCC och för närvarande har 17 arter av B. cepacia-komplexet beskrivits4-7: B. cepacia, B. multivorans, B. cepacia och B. cepacia. cenocepacia, B. stabilis, B. vietanmiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina, B. pyrrocinia, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B. lata och B. contaminans.8

Med undantag för B. ubonensis har alla dessa arter isolerats från sputum från CF-patienter,6,7 med B. cenocepacia och B. multivorans som dominerande.9

B. cenocepacia delas in i fyra subtyper (IIIa, IIIb, IIIc och IIId), som kodas av fyra alleler av genen recA och det finns skillnader i frekvens och virulens hos stammarna. B. cenocepacia anses dessutom vara en av de allvarligaste patogenerna eftersom den ofta är förknippad med minskad överlevnad och högsta risk för utveckling av det fatala cepaciasyndromet.10 BCC-arter är i sig resistenta mot många antibiotika, t.ex. aminoglykosider och polymyxin B, och kräver ofta kombinationsbehandling för att undertrycka infektionen vid CF.11

Infektioner med BCC-bakterier hos CF-patienter är ofta korrelerade med ökad morbiditet och mortalitet, och den medfödda resistensen hos dessa organismer mot ett brett spektrum av antibiotika komplicerar behandlingen av infekterade patienter.12,13 Resistensen orsakas av olika mekanismer, inklusive begränsad permeabilitet, förändringar i lipopolysackaridstrukturen och förekomsten av flera multidrug efflux-pumpar, inducerbara kromosomala betalaktamaser och förändrade penicillinbindande proteiner. Dessutom har biofilmsbildning in vitro beskrivits för flera stammar av B. cepacia-komplexet och detta kan bidra till deras förmåga att överleva i CF-lungemiljön genom att ge ytterligare skydd mot antibiotika.14-16

Behandlingen av BCC-infekterade patienter bör företrädesvis baseras på resultaten av känslighetstester och innefattar ofta kombinationsbehandling med två eller tre antibiotika som uppvisar synergistisk aktivitet.12,17,18In vitro-undersökningar av känslighet för BCC-stammar visar att brytpunktskoncentrationer av ceftazidim, ciprofloxacin, meropenem, tetracykliner eller höga doser av tobramycin har en bakteriostatisk aktivitet mot en avsevärd andel av dessa stammar.19-21 Följaktligen används dessa antibiotika ofta för att behandla BCC-infekterade CF-patienter. Dessutom används fortfarande ofta kotrimoxazol vid behandling av kroniska BCC-infektioner, även om känslighetstester av dessa kompletterande antibiotika avslöjade en dålig aktivitet mot många BCC-stammar.18,22

Syftet med den här studien var att bedöma den isolerade och känsligheten hos BCC och att analysera de kliniska återverkningarna.

Metoder

Sputumet från patienter med CF analyserades för att fastställa slutgiltiga BCC-isolat, vid CF-enheten för vuxna på sjukhuset La Princesa som har varit i drift sedan mars 1997. Dessa prover behandlades på mikrobiologiavdelningen enligt standardförfarandet23; vi använde specifikt selektivt medium och kvantifierande streck, med användning av det konventionella förfarandet med seriell spädning av provet. Sputumet genomgick en homogeniseringsprocess med N-acetylcystein innan det odlades. I vårt laboratorium användes följande odlingsmedier: blodagar, bacitracinchokladagar, manitolsaltagar, MacConkey-agar, Sabouraud cloranfenicol-agar och selektivt medium för B. cepacia kallat BCSA (Biomèrieux). Inkuberingstiden för plattorna var 3-5 dagar vid 35 °C. Bacitracinchokladagar inkuberades i CO2-atmosfär.

Den preliminära identifieringen av BCC-stammarna utfördes med MicroScan (Siemens) och Api 20 NE (Biomerieux). Dessa förfaranden utfördes enligt tillverkarens rekommendationer.24

Därefter skickades stammarna till Centro Nacional de Microbiología (Majadahonda, Madrid) för bekräftelse och bestämning av art och genospecie. För denna studie användes följande metoder: Api 20 NE (biomerieux, Marcy l’Etoile) och GN2 Microplate (BIOLOG, Hayward, CA) och molekylära metoder. Alla förfaranden utfördes enligt tillverkarens rekommendationer.

Extraktion av kromosomalt DNA

DNA-extraktion utfördes med det kommersiella kitet QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Tyskland) enligt tillverkarens anvisningar.

PCR-analys

Amplifiering av gener utfördes i en slutvolym på 25 μl med hjälp av kitet PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) och innehöll 5 μl extraherat DNA och 10 pmol av varje primer: fD1 och rP225 för 16S rDNA, och BCR1 och BCR426 för recA. Termisk cykling utfördes i en TaKaRa PCR Thermal Cycler v. III mod TP600 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Shiga) under följande förhållanden för 16S rDNA: 94°C i 5 minuter för den första cykeln, 35 cykler med 15 sekunder vid 94°C, glödgning i 15 sekunder vid 55°C och förlängning vid 72°C i 1 minut och 50 sekunder. Förutsättningarna för amplifiering av recA var följande: Vi visualiserade 2 μl av varje PCR-produkt genom agarosgelelektrofores med agaroskoncentrationen justerad till 1,5 % och med användning av 1× TAE-buffert. Markörer för molekylstorlek fanns med på alla geler: Marker X 0,07-12,2 kbp (Roche Applied Sciences, Mannheim, Tyskland) och GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Tyskland) för 16s rDNA- respektive recA-produkter.

Stammar som identifierades som B. cenocepacia utsattes för PCR-metoden med specifika primers för RecA-IIIA-gruppen (BCRG3A1 och BCRG3A2) och RecA-IIIB (BCRG3B1 och BCRG3B2) under förhållanden som tidigare beskrivits24.

Ten μl PCR-produkter visualiserades genom agarosgelelektrofores under samma förhållanden som beskrivits ovan.

Nukleotidsekvensanalys

16s rDNA- och recA-PCR-produkter sekvenserades med fD1 och rP2 respektive BCR1 som primers. Sekvenseringsreaktioner förbereddes med hjälp av Big Dye Terminator v 3.1 (Applied Biosystem, USA) i en slutvolym på 10 μl i enlighet med tillverkarens anvisningar och analyserades med ABI PRISM 3100 genetic analyzer capillary electrophoresis system (Applied Biosystem, USA). Sekvenserna sammanställdes med hjälp av programvaran SeqMan 3.61 (DNA Star, Inc, Madison, WI, USA). Vid analysen användes också Basic Local Alignment Search Tool (BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov) för att fastställa den korrekta genidentiteten.

PFGE-analys

Stammarnas släktskap analyserades med hjälp av pulsed-field gelelektrofores (PFGE). Pluggarberedning, lysering, celltvätt och restriktionssmältning utfördes enligt tidigare beskrivning25,26 med små skillnader. Restriktionsenzym XbaI (40U, Fermentas GmbH, St Leon-Rot, Tyskland) användes. PFGE utfördes enligt det protokoll som beskrivs för Stenotrophomonas maltophilia av Valdezate et al.27 och med DRIII Chef System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA) och lambdafager concatemers (Biolabs, New England, UK) som molekylärviktsmarkör. Bilderna togs med programvaran Quantity One v. 4.6.1 (BioRad). Bildanalysen utfördes visuellt och isolaten betraktades som genotypiskt omöjliga att särskilja om de hade ett identiskt bandningsmönster.

Antibiotikakänslighet utfördes genom mikrodilution med MicroScan och diskdiffusion samtidigt. Båda metoderna betraktades som CLSI:s brytpunkter.28 För ciprofloxacin och imipenem användes brytpunkterna för levofloxacin respektive meropenem. Följande antibiotika undersöktes: ceftazidim, ciprofloxacin, levofloxacin, cotrimoxazol, minocyklin, imipenem och meropenem.

Patienter med BCC studerades med följande variabler: ålder (i början och för närvarande), kön, vikt (i början och för närvarande), genmutationen Cystic Fibrosis Transmembrana Regulator, utvecklingen av andningsfunktionen som bestämdes av procentsatsen enligt det teoretiska värdet av volymen som andas ut i den första sekunden (FEV1) från deras första isolering samt de radiologiska punktskrifterna av Brasfield och klinikerna av Shawchman i början av BCC-isoleringen och för närvarande.

Ko-kolonisering med andra mikroorganismer bedömdes.

Brasfieldpoängen utvärderades med 0-5 (från låg till hög) enligt radiologiska tecken: luftinlåsning, linjära skuggor, nodulära cystiska lesioner, segmentell eller lobär konsolidering och helhetsintrycket av svårighetsgraden. Den erhållna globala punktligheten subtraherades till 25. Det lägsta värdet som uppnåddes motsvarade en allvarligare radiologi. Röntgenundersökningen av bröstkorgen och dess motsvarighet till Brasfield-poängen genomfördes varje år.

Klinisk poäng Shwachman utvärderade 4 punkter med maximal interpunktion på 25 vardera: allmän aktivitet, fysisk undersökning, tillväxt och näring samt röntgenundersökning av bröstkorgen. Den ideala interpunktionen var 100 och patienternas status klassificerades enligt interpunktionen: utmärkt (86-100 poäng), bra (71-85 poäng), lätt (56-70 poäng), måttlig (40-55 poäng) eller allvarlig (mindre än eller lika med 40).

Resultat

BCC isolerades hos 12 av 70 vuxna CF-patienter (17,1 %) under 10 år. Två av patienterna hade en lungtransplantation, en av dem dog efter transplantationen och den andra, BCC utrotades 2005 innan transplantationen som var 2011. BCC utrotades hos den andra patienten 2009. Dessa patienter studerades endast under några månader, och därför registrerades inte klinikutvecklingen. B. cenocepacia isolerades hos 4 patienter (33,3 %), B. contaminans hos 3 patienter (25 %), B. stabilis hos 2 patienter (16,7 %), B. vietnamiensis hos 2 patienter (16,7 %), B. cepacia hos en patient (8,3 %), B. multivorans hos en patient (8,3 %) och B. lata hos en patient (8,3 %). Bland B. cenocepacia identifierades subtyp IIIa hos två av fyra patienter (50 %) och subtyp IIIb hos de andra två patienterna (50 %). En patient hade först B. cenocepacia och sedan B. lata. På samma sätt hade en annan patient B. stabilis och sedan B. contaminans. I vår studie hade 50 % av patienterna med BCC Staphylococcus aureus-stammar (tabell 1).

PFGE-analysen visar att samma stam isolerades hos varje CF-patient, men att den skiljde sig åt mellan patienterna, vilket intygar att det inte förekom någon korsöverföring.

90 % av BCC var känsliga för meropenem, 80 % för cotrimoxazol, 60 % för minocyklin, 50 % för ceftazidim och 40 % för levofloxacin, 20 % för ciprofloxacin och 10 % för imipenem.

50 % av CF-patienterna var män och genomsnittsåldern för när dessa patienter fick sin första isolering av BCC var 24,4 (SD: 7,71). De 41,7 % av patienterna hade F508del/annan mutation, 33,3 % hade F508del/F508-mutation och 25 % hade annan/annan mutation.

I början beräknades Brasfield- och Shwachman-poängen för alla patienter som ingick i den här studien och den genomsnittliga punktligheten var 18,6 och 82,3. Den nuvarande Brasfield- och Shwachmanpoängen utförs dock med patienter som koloniserats. Den genomsnittliga punktligheten var 21,1 och 81. Endast 1 patient hade diabetes och 6 patienter hade pankreasinsufficiens. Tabell 2 visar de kliniska egenskaperna hos de CF-patienter som hade BCC.

Fig. 1 visar utvecklingen av lungfunktionen (%FEV1) hos de patienter som hade mer än en isolering av BCC.

Fig. 1.

Utveckling av lungfunktionen hos kroniska CF-patienter från den första isoleringen av BCC i sputum.

(0,1MB).

Diskussion

Det finns få studier som rör den kliniska utvecklingen hos patienter med en isolerad art av BCC, och det finns en allmän uppfattning om att B. cenocepacia-arten är förknippad med större sjuklighet och dödlighet hos CF-patienter19. Därför finns det inte många aktuella uppgifter om patienter med BCC i Spanien. En studie på Hospital Universitario de Cruces visar en ökning av kolonisationsincidensen med BCC.29

Det är viktigt att identifiering av BCC-arter utförs på specialiserade centra, eftersom facultativa hjälper till att övervaka en noggrann övervakning av dessa patienter som koloniseras av dessa arter, eftersom de kan utvecklas negativt.

En studie som utfördes av Van Pelt et al.30 visar att API 20 NE var mer exakt än MicroScan. 90 % av isolaten identifierades korrekt med API 20 NE jämfört med 68 % med MicroScan. De föreslår användning av BCSA-plattor för initial isolering av B. cepacia direkt från kliniskt material. Känsligheten för dessa tillväxtmedier verkade vara utmärkt (96 %); specificiteten var inte 100 %. Det var ganska slående att konstatera att noggrannheten var otillräcklig för de automatiserade testerna, som MicroScan. Det viktigaste resultatet av denna analys är att molekylär identifiering genom PCR-RFLP-analys är överlägsen de biokemiska och mikrobiologiska artbestämningsförfarandena, även om det bör betonas att de resultat som erhållits med API20 NE var tillfredsställande.30

I vår studie isolerades B. cenocepacia, B. contaminans, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. multivorans, B. cepacia och B. lata från luftvägssekret från 12 undersökta CF-patienter och B. cenocepacia var den vanligaste arten i likhet med de flesta uppgifter som beskrivits i europeisk litteratur om CF-patienter.19 Denna upptäckt stämmer dock inte överens med en studie i Portugal (Susana Correia et cols), där de vanligaste arterna var B. cepacia 57 % och B. stabilis 13 %. Det kan bero på att man använde icke-sterila saltlösningar som i sig var kontaminerade av B. cepacia.19 Dessa kontaminerade lösningar upptäcktes av Infarmed under en mikrobiologisk rutininspektion.19 I vår studie isolerades B. cepacia och B. stabilis i lägre grad än i andra studier i Europa och Amerika.19

Av B. cenocepacia isoleringen var det samma andel mellan B. cenocepacia subtyp IIIa och IIIb.

En av patienterna hade B. cenocepacia som första isolering, B. lata som andra isolering och blev sedan eradikerad. En annan patient hade B. vietnamiensis 2004 som utrotades, och lungtransplantation gjordes hos honom 2011, och en annan patient isolerades med B. cenocepacia subtyp IIIa 2004, men han avled samma år efter en lungtransplantation. Överlevnadsresultaten av lungtransplantation är sämst hos patienter som är koloniserade med B. cenocepacia, så vissa transplantationsenheter kontraindicerar transplantationen i det fallet. Det har erkänts att B. cenocepacia har en sämre prognos jämfört med B. multivorans med kortare överlevnad när den matchas med Pseudomonas aeruginosa-kontroller.31 Cepacia-syndromet har rapporterats med båda dessa arter.26 Den exakta patofysiologin för detta syndrom är dåligt förstådd, och den exakta dödligheten är inte känd, även om den tros närma sig 100 %.32

Våra patienter har låga FEV1-värden. Ett stort antal patienter hade redan försämrats före BCC-isoleringen till följd av kolonisering med andra patogena agens och sjukdomsprogression. Hos kliniskt stabila patienter sågs inga signifikanta förändringar i FEV1-värden och näringstillstånd. Det finns belägg för att lungkolonisering kanske inte upptäcks med standardkulturer under en viss tid (upp till 2 år) efter det att BCC förvärvats.33 Dessutom är det inte klart om det vid intermittent isolering sker en återinfektion med en ny stam eller om den ursprungliga stammen rekonsumerar.20 I majoriteten av fallen i vår olika isolering sågs ingen ersättning av de ursprungliga BCC-stammarna.

Fall registrerades där samma stam (med samma genotyp), som ihållande infekterade en patient under flera år, utrotades genom antibiotikabehandling eller inte hade någon uppenbar inverkan på den kliniska bilden hos andra patienter. Det är inte klart varför stammar av de olika BCC-arterna skiljer sig åt när det gäller persistens, epidemiologi och patogen potential i CF och varför samma stammar kan förknippas med mycket olika kliniska utvecklingar.19 Det beror på faktorer som är inneboende i varje enskild patient, på samkolonisering med andra patogener och andra faktorer som ännu inte har identifierats, vilket understryker vikten av att genomföra studier av denna typ.19

Antibiotikaresistens anses vara en viktig virulensfaktor hos BCC-organismer.14 Även om terapin vanligen styrs av tester av antimikrobiell känslighet uppnås sällan utrotning av BCC-organismer.21 Flera hypoteser har formulerats för att förklara detta misslyckande, bland annat otillräckliga antibiotikakoncentrationer eller inaktivering av antibiotikan i sputum, nedsatt värdförsvar hos CF-patienter, biofilmbildning, ”inokulum”-effekt och in vivo-tillväxthastighet hos dessa organismer.34

Elke et al. rapporterade i en belgisk studie att meropenem, minocyklin och ceftazidim var de mest aktiva antibiotika mot BCC-isolering och att ciprofloxazin och trimetoprim/sulfametoxazol hade den lägsta aktiviteten.35 I vår studie konstaterades dock att meropenem var mest aktivt med 90 % av känsligheten, följt av trimetoprim/sulfametoxazol, minocyklin och ceftazidim med 80 %, 60 % respektive 50 %. Även om BCC-organismer vanligtvis är resistenta mot aminoglykosider hämmade höga doser av tobramycin majoriteten av de testade stammarna. Tobramycin i nebulisatorform som ger höga toppkoncentrationer i sputum används i allt större utsträckning för behandling av CF-patienter.36-38

Följaktligen bör dessa högre koncentrationer beaktas när man utvärderar användbarheten av detta antibiotikum.35 Flera rapporter bekräftar att nebuliserat tobramycin är mycket lovande vid behandling av BCC-infekterade CF-patienter: till exempel beskrev Weidmann et al.39 nyligen en fullständig utrotning av BCC-organismer från CF-patienters lungor med hjälp av en kombination av nebuliserat tobramycin och amilorid. Dessutom resulterade en kombinationsbehandling med nebuliserat och intravenöst meropenem och tobramycin också i en framgångsrik behandling av en kvinnlig CF-patient som led av cepacia-syndromet, även om sputumproverna från den sistnämnda patienten förblev positiva för B. cenocepacia.39

BCC-arter är i sig resistenta mot många antibiotika, t.ex. aminoglykosider och polymyxin B, och kräver ofta kombinationsbehandling för att undertrycka infektionen vid CF.11 Antibiotikan polymyxin, gentamicin och vankomycin används i höga koncentrationer i B. cepacia Selective Agar, ett mycket effektivt medium för isolering av dem från sputum från CF.11 Nzula et al.13 jämförde antibiotikakänsligheten hos sex BCC-arter och drog slutsatsen att den var mycket varierande, med undantag för den medfödda polymyxinresistensen, och att den inte var kopplad till de undersökta isolatens taxonomiska status. Efflux, sekretion av kromosomala beta-laktamaser och den yttre höljets ogenomtränglighet hos BCC-bakterier har varit inblandade i antibiotikaresistens14 .

Däremot har den molekylära grunden för biocidresistens hos BCC-bakterier studerats dåligt trots att dessa organismer är kopplade till många fall av kontaminering i desinfektionsmedel och andra anti-infektionslösningar.40

Uppdraget och därmed den utmaning som identifiering av BCC-arter innebär för rutinmässiga laboratorier för klinisk mikrobiologi är annorlunda. Stammar som isolerats på selektiva medier och som preliminärt identifierats som tillhörande BCC med hjälp av kommersiella system bör bekräftas med de klassiska biokemiska tester som beskrivits.41

Den tidiga upptäckten av BCC är oerhört viktig både för CF-patienten och för CF-samhället. En nyligen genomförd studie5 visade dock att mindre än hälften av de undersökta centra i USA använder ”B. cepacia”-specifika selektiva medier eller inkuberar kulturer under längre perioder, vilket i båda fallen förbättrar utbytet av denna organism. Användningen av dessa uppdaterade odlingstekniker är tekniskt sett inte krävande och bör vara den förväntade vårdstandarden på alla CF-center världen över.

I den här studien utrotade vi bara B. cenocepacia hos en patient; en annan patient dog omedelbart efter transplantationen, och ingen av patienterna hade cepacia-syndromet och drabbades av en viktig klinisk försämring, även om observationsperioden var kort eftersom de fick BCC nyligen.

En förbättrad diagnos av infektioner orsakade av medlemmar av BCC och andra B. cepacia-liknande organismer kommer att bidra till tolkningen av resultaten från studier av kliniska resultat, och därigenom kommer den att ge viktig information om patogeniciteten och/eller överförbarheten hos specifika stammar i fråga.5

Intressekonflikter

Ingen av författarna har några intressekonflikter att deklarera.