Betydelsen av effluxpumpar för bakteriell antibiotikaresistens

Effluxpumpar är transportproteiner som är involverade i extruderingen av toxiska substrat (inklusive praktiskt taget alla klasser av kliniskt relevanta antibiotika) från cellens inre till den yttre miljön. Dessa proteiner finns i både grampositiva och -negativa bakterier samt i eukaryota organismer.1 Pumpar kan vara specifika för ett substrat eller transportera en rad strukturellt olikartade föreningar (inklusive antibiotika av flera klasser); sådana pumpar kan förknippas med multipel läkemedelsresistens (MDR). I det prokaryotiska riket finns det fem huvudfamiljer av effluxtransportörer:2 MF (major facilitator), MATE (multidrug and toxic efflux), RND (resistance-nodulation-division), SMR (small multidrug resistance) och ABC (ATP binding cassette). Alla dessa system använder protonmotivationskraften som energikälla,3 bortsett från ABC-familjen, som använder ATP-hydrolys för att driva exporten av substrat. De senaste framstegen inom DNA-tekniken och den genomiska eran har lett till att många nya medlemmar av ovanstående familjer har identifierats, och det är anmärkningsvärt att effluxpumparna är allestädes närvarande. Transportörer som ger utflöde av flera substrat, inklusive antibiotika, har inte utvecklats som svar på de påfrestningar som antibiotikaeran innebär. Alla studerade bakteriegenom innehåller flera olika effluxpumpar, vilket tyder på att de har ett ursprung från förfäderna. Det har uppskattats att ∼5-10 % av alla bakteriegener är involverade i transport och en stor andel av dessa kodar för effluxpumpar.2,4

Det råder viss debatt om effluxtransportörernas ”normala” fysiologiska roll, eftersom antibiotikakänsliga såväl som resistenta bakterier bär och uttrycker dessa gener. I många fall ingår effluxpumpsgener i ett operon med en regulatorisk gen som kontrollerar uttrycket. Ökat uttryck är förknippat med resistens mot substratet, t.ex. är resistens mot gallsalter och vissa antibiotika i Escherichia coli förmedlad av överexpression av acrAB.5 Även om gener som kodar för effluxpumpar kan hittas på plasmider, ger bärandet av effluxpumpsgener på kromosomen bakterien en inneboende mekanism som gör det möjligt att överleva i en fientlig miljö (t.ex. närvaron av antibiotika), och därför kan muterade bakterier som överuttrycker effluxpumpsgener väljas ut utan att man behöver förvärva nytt genetiskt material. Det är troligt att dessa pumpar uppstod för att skadliga ämnen skulle kunna transporteras ut ur bakterien och möjliggöra överlevnad. Det är nu allmänt accepterat att Gram-negativa bakteriers ”inneboende resistens” mot vissa antibiotika i förhållande till Gram-positiva bakterier är ett resultat av effluxsystemens aktivitet6 . Effluxsystem som bidrar till antibiotikaresistens har beskrivits från ett antal kliniskt viktiga bakterier, däribland Campylobacter jejuni (CmeABC7,8), E. coli (AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, EmrB, EmrD9), Pseudomonas aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN och MexXY-OprM9), Streptococcus pneumoniae (PmrA10), Salmonella typhimurium (AcrB11) och Staphylococcus aureus (NorA12). Alla dessa system exporterar fluorokinoloner och RND-pumparna (CmeB, AcrB och Mex-pumparna) exporterar också flera antibiotika.

Överuttryck av effluxpumpar kan bero på mutationer i lokala repressorgener13-15 eller kan bero på aktivering av ett regulon som regleras av en global transkriptionsregulator, t.ex. MarA eller SoxS i E. coli.16,17 Effluxsystemens breda substratområde är oroande, eftersom överuttryck av en pump ofta leder till resistens mot antibiotika av mer än en klass samt vissa färgämnen, rengöringsmedel och desinfektionsmedel (inklusive vissa vanligt förekommande biocider). Korsresistens är också ett problem. Exponering för ett medel som ingår i substratprofilen för en pump skulle gynna överuttryck av den pumpen och därmed korsresistens mot alla andra substrat för pumpen. Dessa kan innefatta kliniskt relevanta antibiotika. Mutanter som överproducerar MexAB är mindre mottagliga, om inte helt resistenta mot en rad antibiotika (fluorokinoloner, β-laktamer, kloramfenikol och trimetoprim), men också mot triclosan, en vanligt förekommande biocid för hushållsbruk18 . Den potentiella missbruket av biocider och det möjliga urvalet av bakterier som är korsresistenta mot antibiotika har nyligen debatterats i denna tidskrift och på andra ställen.19-22 Överuttryck av en utflödespump för multiresistens ger i sig själv ofta inte någon hög nivå av kliniskt signifikant resistens mot antibiotika. Sådana bakterier är dock bättre rustade för att överleva antibiotikatrycket och utveckla ytterligare mutationer i gener som kodar för antibiotikans målpunkter.23 Det har visats att fluorokinolonresistenta stammar av E. coli selekteras 1000 gånger lättare från mar-mutanter än vildtypbakterier,24 och mycket fluorokinolonresistenta E. coli innehåller mutationer i gener som kodar för topoisomerasenzymerna som är måltavlor och har minskad ackumulering och ökat utflöde (nedreglering av porin och överexpression av utflödespumpen).14,15 Additiva ökningar av MIC för antibiotika har också setts efter samtidig överexpression av mer än en pump av olika klasser, vilket också har resulterat i högresistenta E. coli.25

Det har visats att uttrycket av Mex-systemen hos P. aeruginosa och acrAB-utflödessystemet hos E. coli är störst när bakterierna är stressade, t.ex. tillväxt i ett näringsfattigt medium, tillväxt till stationär fas eller osmotisk chock; dessa ogästvänliga förhållanden kan vara relevanta för situationen inom en infektion.26,27 Oreglerat överuttryck av effluxpumpar är potentiellt ofördelaktigt för bakterien eftersom inte bara toxiska substrat exporteras utan även näringsämnen och metaboliska intermediärer kan gå förlorade. Arbete med P. aeruginosa har visat att mutanter som överuttrycker Mex-pumpar har sämre förmåga att motstå miljöstress och är mindre virulenta än sina motsvarigheter av vildtyp.28 Som ett resultat av detta är uttrycket av pumpar noggrant kontrollerat. Mutanter och kliniska isolat som överuttrycker effluxpumpar är dock stabila och ofta isolerade; det kan vara så att sådana mutanter ackumulerar kompensationsmutationer som gör att de kan växa lika bra som vildtypbakterier.

Nyligen har användningen av effluxpumphämmare undersökts för att förbättra och potentiera aktiviteten hos exporterade antibiotika. En sådan strategi har använts för att utveckla hämmare som minskar effluxpumparnas inverkan på fluorokinolonaktiviteten. Eftersom många effluxpumpar har en betydande strukturell homologi är förhoppningen att en inhibitorförening ska vara aktiv mot en rad pumpar från olika bakteriearter. Den mesta forskningen har varit inriktad på P. aeruginosa Mex effluxpumpar och hämmare av dessa. En sådan hämmare sänkte MIC-värdena för fluorokinoloner för både känsliga och resistenta stammar.2 Dessutom var selektionsfrekvensen av fluorokinolonresistenta stammar också lägre i närvaro av hämmaren, vilket tyder på att efflux kan vara viktigt vid selektion av fluorokinolonresistens. Liknande observationer har gjorts för S. pneumoniae och S. aureus.29,30 Ett krav på ett intakt effluxsystem för att möjliggöra utveckling av topoisomerasmutationer och därmed fluorokinolonresistens hos E. coli har också beskrivits.31 Kopplingen mellan aktivt efflux och mutationer i gener som kodar för målplatsproteiner antyder att användningen av sådana hämmare, i förening med substratantibiotika, kan vara användbar genom att öka både aktiviteten och antalet arter för vilka ett läkemedel kan vara effektivt. Vid utformning av nya läkemedel och modifiering av befintliga molekyler bör man nu också ta hänsyn till effluxpumpar. Strukturella förändringar som minskar ett antibiotikums förmåga att bli utflöde utan att äventyra dess aktivitet kan leda till utveckling av mer potenta föreningar, men man måste nu verkligen ta hänsyn till läkemedlens ”utflödesförmåga” när man utvecklar medel med hänsyn till deras totala effektivitet och sannolikheten för utveckling av resistens.

Sammanfattningsvis finns det allt fler bevis för att utflödespumparna spelar en viktig roll för antibiotikaresistens hos bakterier. Även om resistens på hög nivå kanske inte uppstår enbart på grund av MDR-effluxpumpar, kan man inte bortse från sambandet med överuttryck av dessa gener bland högresistenta kliniska isolat. Den inneboende antibiotikaresistensen hos vissa arter kan också till stor del bero på effluxpumpar. Selektion av effluxmutanter genom biocider som förekommer i miljön är ett potentiellt problem. Det krävs mer arbete för att kvantifiera risken, om någon, från en sådan process. Synergiska ökningar av resistensen som ses med överuttryck av effluxsystem och mutationer på målplatsen kan leda till högresistenta bakterier som är svåra att behandla. Effekten av effluxpumpar måste beaktas vid utformningen av framtida antibiotika och hämmarnas roll måste utvärderas för att maximera effekten av nuvarande och framtida antibiotika.

För dem som är intresserade finns det ett antal utmärkta översiktsartiklar som fokuserar på effluxpumpar.2,3,9,11,32,33