Avfosforylering

V.B Proteinfosfataser i RPTK-signalering

Tyrosinavfosforylering är en annan snabbverkande mekanism för att hämma eller avsluta signalering från RPTK:er. Proteinfosforylering vid signaltransduktion är reversibel, och PTK:er agerar tillsammans med PTPaser för att bestämma initiering, omfattning och avslutande av tyrosinfosforylering. Nedreglering av RPTK-signalering sker inte bara genom direkt fosfotyrosinavfosforylering av själva RPTK:n (dvs. RPTK:n är ett substrat för PTPaset), utan också genom avfosforylering av ett avgörande nedströmsmål för RPTK:n. Eftersom tyrosinfosforylerade proteiner, serin- och threoninfosforylerade proteiner och till och med fosfolipider är mediatorer av RPTK-signalering finns det exempel på proteinserin/treonin-specifika fosfataser och fosfoinositidspecifika lipidfosfataser som också medierar nedreglering av RPTK-initierad signalering. Några exempel följer, liksom en kort allmän beskrivning av proteinfosfataser.

Alla identifierade PTPaser innehåller en konserverad, ∼280 aminosyror lång PTPasedomän. Deras specifika katalytiska aktivitet är ungefär 1000 gånger högre och mycket mindre specifik än PTKs. Precis som för PTK:er kan PTPaser delas in i transmembran- och cytoplasmatiska PTPaser. Transmembran-PTPaser innehåller extracellulära regioner med motiv som fibronectin typ III-liknande upprepningar, cadherin-liknande upprepningar och immunoglobulin-liknande domäner. De har en enda transmembranöverskridande region som vanligen följs av två PTPase-domäner, varav endast en tycks bidra med katalytisk aktivitet. Som deras extracellulära region tyder på är vissa transmembran-PTPaser, t.ex. PTPκ och PTPμ, involverade i homofil cellcellsadhesion, och PTPμ kan stabilisera cellcellskontakter genom att defosforylera cateniner och cadheriner. Dessa och andra transmembran-PTPaser har inte involverats i direkt defosforylering av RPTKs, till skillnad från de cytoplasmatiska PTPaserna, av vilka flera kan direkt defosforylera RPTKs.

Det hematopoietiskt uttryckta, cytoplasmatiska proteintyrosinfosfataset SHP-1 är ett av endast två identifierade SH2-domäninnehållande PTPaser. SHP-1 binder till aktiverade RPTKs, som CSF-1 och Kit/SCF-receptorn, genom någon av sina två SH2-domäner. SHP-1:s och den strukturellt besläktade SHP-2:s (se senare) SH2-bindning avhjälper en autoinhibitorisk begränsning av PTPas-domänen. Följaktligen har det visats att både CSF-1- och Kit/SCF-receptorerna är direkta substrat för SHP-1 och att SHP-1 är viktig för den normala nedregleringen av Kit- och CSF-1-receptorns signalering. Detta har också fysiologisk relevans. Möss med fenotypen motheaten (me), som beror på naturligt förekommande LOF-mutationer (loss-of-function) i SHP-1, har därför många hematopoetiska avvikelser på grund av hyperproliferation av myeloida/monocytära celler och mastceller. Den avreglerade CSF-1- och Kit-receptorsignaleringen tros orsaka dessa defekter, vilket stöds av studier som visar att fenotypen hos dominant white-spotting (W)-mutanta möss, som har naturligt förekommande LOF-mutationer i Kit, lindras genom korsning med me-mutanta möss, och vice versa. Dessa och nyare data som visar alternativa transkript som orsakar antingen trunkeringar av SHP-1 eller frameshift-mutationer som resulterar i förlust av SHP-1 i primära Kit-uttryckande tumörcellslinjer etablerade från leukemiska patienter, tyder på att SHP-1 är en tumörsuppressor.

Proteintyrosinfosfataset PTP1B är ett annat cytosoliskt fosfatas, som är involverat i den direkta nedregleringen av RPTK-signalering. PTP1B binder till de aktiverade insulin- och IGF-1-receptorerna genom sin N-terminala katalytiska domän genom en okänd mekanism. Vid bindning avfosforylerar PTP1B direkt själva insulinreceptorn och dess viktigaste associerade dockningsprotein, insulinreceptorsubstrat-1 (IRS-1). Följaktligen orsakar riktad borttagning av PTP1B hos möss hyperfosforylering av insulinreceptorn och IRS-1 och sensibilisering av insulinsignalering. PTP1B defosforylerar också STAT5a och STAT5b och förhindrar därmed deras nukleära translokation och transkriptionella aktivitet. STAT5a och STAT5b fosforyleras av JAKs som aktiveras av cytokinreceptorer, men fosforyleras också direkt av flera RPTKs.

PTP1B, liksom den receptorliknande PTPα och SHP-2, ett annat SH2-domäninnehållande fosfatas, har emellertid också involverats i förstärkningen av signalering nedströms från RPTKs. PTP1B överuttrycks i bröstcancercellinjer där den orsakar defosforylering av Tyr527 vid c-Src:s C-terminus. Detta leder till ökad Src-kinasaktivitet, eftersom fosforylering av denna plats är hämmande för Src-aktivitet genom en allosterisk, autoinhibitorisk mekanism. Den transmembranära RPTPα är tyrosinfosforylerad in vivo vid Tyr789, vilket skapar en bindningsplats för c-Src, vilket gör det möjligt för RPTPα att defosforylera Tyr527 i Src in vitro. Intressant nog är både bindning och avfosforylering av Src beroende av fosforylering vid Tyr789, och en fosfotyrosinförskjutningsmekanism har föreslagits för aktiveringen av Src av RPTPα. Följaktligen upphäver kinasdefekta eller Tyr789Phe-mutanter av RPTPα neoplastisk omvandling genom överuttryckt RPTPα, och riktad störning av RPTPα orsakar en minskad aktivitet hos Src-familjemedlemmar i celler från de muterade mössen, vilket korrelerar med ökade fosforyleringsnivåer av Tyr527. SHP-2, som uttrycks ubiquitärt, associerar in vivo via sina SH2-domäner med många RPTK:er och PTK-substrat, inklusive receptorerna för PDGF, EGF, insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) och SCF, samt dockningsproteinet IRS-1. SHP-2 blir tyrosinfosforylerad som svar på stimulering med flera tillväxtfaktorer, och tyrosinfosforylerad SHP-2 binder till receptorerna för antingen PDGF eller SCF samt adaptormolekylen Grb2. Den bundna SHP-2 har i sin tur visat sig selektivt defosforylera tyrosinrester i PDGFR-β som är viktiga för bindning av PI 3′-kinas och GAP för Ras. Dessutom hämmar mikroinjektion av blockerande antikroppar mot SHP-2 eller uttryck av SHP-2 SH2-domäner eller av katalytiskt inaktivt SHP-2 mitogenes som stimuleras av EGF, insulin och IGF-1. Dessa resultat tyder på att SHP-2 är en uppströmsaktivator av Ras-signalering och andra Grb2-reglerade signalvägar och möjligen en modulator av RPTK-inducerad PI 3′-kinas-signalering. I likhet med SHP-1 kan bindning av SHP-2 aktivera dess katalytiska funktion. SHP-2 påstås också avfosforylera Tyr527 i Srcs C-terminus, vilket ger ytterligare positiv reglering av signalering.

Flera proteinserin/treoninkinaser och substrat av dessa avfosforyleras av det stora serin/treoninspecifika fosfataset PP2A. Detta är ett cytoplasmatiskt och nukleärt heterotrimert fosfatas som består av en strukturell A-underenhet. en regulatorisk B-underenhet och en katalytisk C-underenhet, PP2A är bundet till ett flertal scaffoldproteiner genom sin regulatoriska underenhet, och dess aktivitet regleras noggrant i samband med sammansatta scaffolds. Ett av de viktiga substraten i RPTK-signalering är PI 3′-kinasets mål Akt, ett proteinserin/treoninkinas som medierar cellöverlevnad delvis genom fosforylering av Bcl-2-familjemedlemmen Bad. PP2A avfosforylerar den aktiverande fosforyleringsplatsen T308 i Akt, som är avgörande för kinasaktiviteten. Dessutom kan PP2A avfosforylera den antiapoptotiska molekylen Bcl-2, vilket upphäver dess överlevnadsfunktion. Många andra substrat för PP2A har identifierats, varav många är viktiga nedströmsmål för RPTK:er.

Två fosfoinositidspecifika fosfataser, PTEN respektive SHIP1/2, avfosforylerar specifikt D-3- och D-5-positionen av inositolringen i PtdIns(3,4,5)P3, en av de viktigaste effektorerna av PI 3′-kinas-signalering. Detta motverkar RPTK-initierad PI 3′-kinas-signalering, och följaktligen har PTEN visat sig vara en frekvent muterad mänsklig tumörsuppressorgen. Inaktiverande mutationer i PTEN är avgörande för vissa neuronala, bröst- och könscellstumörer hos människor, vilket är förknippat med ökad aktivitet av Akt.