Anti-fosfatidylserin/protrombin-antikroppar är associerade med negativa graviditetsutfall

Abstract

Objektiv. Att fastställa prevalensen och det kliniska sambandet av anti-fosfatidylserin/protrombin-antikroppar (aPS/PT) hos patienter med en historia av graviditetskomplikationer som är relevanta för antifosfolipidsyndromet (APS). Material och metoder. Tvåhundraelva patienter med en historia av a) tre eller fler på varandra följande missfall före 10:e graviditetsveckan (WG) (), b) död av ett morfologiskt normalt foster efter 10:e WG (), c) för tidig födelse av ett morfologiskt normalt nyfött barn före 34:e WG på grund av eklampsi, preeklamsi och placentainsufficiens () och d) färre än tre oförklarliga på varandra följande missfall före 10:e WG (). Ämnenas serum analyserades med avseende på antikroppar mot lupus antikoagulant (LA), antikardiolipin (aCL), anti-glykoprotein I (anti-GPI) och aPS/PT-antikroppar. Resultat. 41/169 (24,3 %) av patienterna var positiva för minst en uppmätt aPL. Den högsta prevalensen hittades för aPS/PT och aCL (13,0 % respektive 12,4 %) följt av LA (7,7 %) och anti-GPI (7,1 %). 11/169 med APS-relaterade obstetriska manifestationer hade endast aPS/PT. 17,8 % av patienterna var positiva för LA eller aCL och/eller anti-GPI, men när man adderade aPS/PT-resultaten kunde ytterligare 7 % av patienterna utvärderas för APS. Slutsats. aPS/PT är förknippade med återkommande tidiga eller sena aborter och med för tidig förlossning oberoende av andra aPL.

1. Introduktion

Patienter med förhöjda nivåer av antifosfolipidantikroppar (aPL) drabbas ofta av graviditetskomplikationer bestående av återkommande spontana aborter, intrauterin tillväxthämning och preeklampsi, vilket tyder på att dessa antikroppar kan påverka embryonal implantation och inducera trombos i det uteroplacentala kärlsystemet. De internationella klassificeringskriterierna för antifosfolipidsyndrom (APS) kopplar samman förekomsten av obstetriska komplikationer och/eller trombos med persistens av aPL i APS . Laboratoriekriterierna för APS omfattar lupus antikoagulantia (LA), antikardiolipinantikroppar (aCL) och antikroppar mot -glykoprotein I (anti-GPI). Flera andra ”icke-kriterier” aPL tros vara förknippade med APS, men bristen på bevis som bekräftar deras diagnostiska tillämplighet förhindrar hittills att de tas med i klassificeringskriterierna. Under de senaste åren har många studier visat att antiprotrombinantikroppar har ett samband med APS:s patogenes och några av dem har föreslagit att de har en gynnsam roll för APS-diagnosen. Dessa antikroppar kan påvisas med en ELISA som riktar sig mot enbart protrombin (aPT-A) eller mot fosfatidylserin/protrombinkomplexet (aPS/PT), men de sistnämnda är vanligare hos patienter med APS . Vår grupp rapporterade om en intern ELISA för aPS/PT som den optimala metoden för bestämning av kliniskt relevanta antiprotrombinantikroppar som uppvisar den högsta andelen LA i vår patientpopulation . Den kliniska betydelsen av antiprotrombinantikroppar har främst beskrivits för patienter med APS och trombos, men mycket få studier har rapporterat om deras samband med negativa graviditetsutfall. En omfattande genomgång av ”antiprotrombinantikroppar” och ”pregnancy/obstetric/miscarriages/fetal loss” avslöjade 12 studier som omfattade 1031 patienter och 988 kontroller (tabell 1). I hälften av dessa studier kunde man inte finna något signifikant samband mellan antiprotrombinantikroppar och graviditetssjukdomar . Akimoto et al. presenterade däremot ett starkt och specifikt samband mellan olika typer av antiprotrombinantikroppar med svår preeklampsi och spontan abort. Endast studien av Bertolaccini et al. gjorde skillnad mellan olika obstetriska komplikationer och visade ett signifikant samband mellan både aPS/PT och aPT-A och oförklarlig död hos ett morfologiskt normalt foster efter den tionde graviditetsveckan. Den kliniska betydelsen av antiprotrombinantikroppar hos patienter med negativ graviditetsutgång bekräftades senare även av Marozio et al. som undersökte aPT-A och Vlagea et al. som undersökte aPS/PT. Vår grupp har dessutom nyligen rapporterat att aPS/PT är den starkaste oberoende riskfaktorn för obstetriska komplikationer jämfört med LA, aCL och anti-GPI . Hittills har vi dock inte funnit några rapporter som beskriver ett samband mellan antiprotrombinantikroppar och oförklarliga missfall i följd under graviditetens första trimester.

Den här studien syftar därför till att undersöka sambandet mellan aPS/PT och en historia av specifika idiopatiska graviditetskomplikationer i en större patientgrupp och att fastställa om förekomsten av aPS/PT är förknippad med en ökad risk för obstetriska manifestationer som är relevanta för APS.

2. Material och metoder

2.1. Subjekt

Denna studie omfattade 402 seraprover som prospektivt samlades in från 211 konsekutiva kvinnliga patienter (medianålder 33 år, IQR: 7 år) som remitterades mellan 2005 och 2013 till vår klinik på grund av möjlig obstetrisk APS (tabell 2). Av dem hade 169 obstetriska manifestationer som ingick i APS-klassificeringskriterierna. Närmare bestämt hade 64 patienter tre eller fler oförklarliga missfall i följd före den 10:e graviditetsveckan (WG), 72 patienter upplevde oförklarlig död av ett morfologiskt normalt foster efter den 10:e WG, och 33 patienter födde ett morfologiskt normalt nyfött barn i förtid före den 34:e WG på grund av eklampsi, preeklamsi eller placentainsufficiens. Av de 33 för tidigt födda barnen dog fostret i 10 fall till följd av antingen placentaabbrott eller tillväxthämning, utan att några morfologiska avvikelser kunde uteslutas. Det fanns 16 fall med inducerade förlossningar på grund av preeklampsi eller eklampsi och 7 spontana för tidiga förlossningar. De återstående 42 patienterna hade mindre än tre missfall före 10:e WG och uppfyllde inte APS-klassificeringskriterierna.

Alla patienter och deras partners undersöktes för genetiska avvikelser. Majoriteten av patienterna hade fått resultaten av den genetiska analysen när de besökte vår klinik och patienter med bekräftade avvikelser uteslöts från studien.

Som kontrollgrupp inkluderade vi 87 friska kvinnliga blodgivare (medianålder 42 år, IQR: 18 år) utan anamnes på underliggande autoimmuna sjukdomar, blödningsstörningar, trombos och/eller graviditetsmorbiditet.

Alla patienter fick sina sera insamlade i samband med sin kliniska undersökning på avdelningen för reumatologi (University Medical Centre, Ljubljana). Proverna aliquoterades, förvarades vid -20 °C och analyserades därefter. Denna studie genomfördes som en del av det nationella forskningsprogrammet ”Systemiska autoimmuna sjukdomar” (#P3-0314). Deltagarna undertecknade ett informerat samtycke och studien godkändes av den nationella medicinska etikkommittén i Ljubljana, Slovenien.

2.2. LA-bestämning

Plasmaprover analyserades med hjälp av koagulationsanalysatorn BCS Siemens enligt de riktlinjer som gällde när studien inleddes . Förenklat diluerat Russell’s Viper Venom Test (dRVVT) utfördes med hjälp av LA 1 screeningreagens och LA 2 konfirmeringsreagens (Siemens) enligt tillverkarens anvisningar . Ett dRVVVT-förhållande (LA1 screening/LA2 bekräftelse) över 1,2 ansågs vara positivt för LA-aktivitet. Aktiviteten hos LA kvantifierades enligt följande: lågt positiv (LA1/LA2 = 1,2-1,5), medel (LA1/LA2 = 1,5-2,0) och högt positiv (LA1/LA2 > 2,0).

2,3. En intern aPS/PT-ELISA

Denna utfördes enligt tidigare beskrivet protokoll och validerad metod . Specifikt var de genomsnittliga variationskoefficienterna mellan och inom testerna <3,3 % respektive <8,2 %. Den diagnostiska specificiteten för APS var 92,5 % och den diagnostiska känsligheten 59,0 %. Det diagnostiskt relevanta gränsvärdet för aPS/PT fastställdes på den 99:e percentilen av 222 blodgivare. Fosfatidylserin belades kortfattat på polystyrenmikrotiterplattor (mediumbindning, Costar, Cambridge, MA, USA) och inkuberades över natten vid 4 °C. Efter blockering med Tris-buffrad saltlösning (TBS) innehållande 1 % bovint serumalbumin (BSA) och 5 mM CaCl2 (1 % BSA-TBS-Ca++) tvättades plattorna i TBS innehållande 0,05 % Tween-20. Humant protrombin (10 mg/L) (Enzyme Research Laboratories, UK) och patienternas serum utspätt 1 : 100 i 1 % BSA-TBS-Ca++ applicerades på brunnarna omedelbart efter varandra och inkuberades i 1 timme i rumstemperatur. Därefter tvättades plattorna och inkuberades med alkalisk fosfatas-konjugerat get anti-humant IgG eller IgM (ACSC, Westbury, USA) i 30 minuter vid RT. Efter den sista tvätten applicerades para-nitrofenylfosfat (Sigma Chemical Company, USA) i dietanolaminbuffert (pH 9,8) som substrat och OD405 mättes kinetiskt med hjälp av en mikrotiterplattläsare (Tecan, Grödig, Österrike).

2.4. IgG och IgM aCL

Dessa bestämdes i serum med en egen fastfas-ELISA för aCL. Polystyren-mikrotiterplattor (mediumbindning, Costar, Cambridge, MA, USA) belades med kardiolipin (Sigma, St. Louis, USA) och blockerades med 10 % fetalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, USA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter tvättning med PBS applicerades utspädda prover i 10 % FBS-PBS och inkuberades i 2,5 timmar vid RT. Detektionssystemet var detsamma som i aPS/PT ELISA.

2.5. IgG och IgM Anti-GPI

Dessa mättes med en egen ELISA. Kortfattat: högbindande polystyren-mikrotiterplattor belagda med 50 uL/brunn av GPI (10 mg/L) i PBS inkuberades i två timmar vid RT. Plattorna tvättades sedan med PBS innehållande 0,05 % Tween-20 (PBS-Tween) och inkuberades med prover utspädda i PBS-Tween i 30 minuter vid RT. Detektionssystemet var detsamma som i aPS/PT ELISA.

Alla aPL-tester utfördes på samma seraprover. Patienter och kontroller testades vid samma tidpunkt. Ingen av patienterna eller kontrollerna var gravid vid tidpunkten för aPL-bestämningen.

2.6. Statistisk analys

Den statistiska analysen utfördes med hjälp av programmet SPSS 15.0. ROC-analysen (receiver operating characteristic) och arean under kurvan (AUC) användes för att bedöma den diagnostiska prestandan hos den eller de uppmätta markörerna. Resultaten av multivariata logistiska modeller approximerades genom oddskvot med dess 95-procentiga konfidensintervall (OR ). Ett 2-sidigt värde < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.

3. Resultat

Alla patienter som var positiva för någon av de testade aPL testades på nytt minst 12 veckor efter det första besöket och endast permanent förhöjda nivåer av aPL betraktades som ett positivt resultat. Prevalensen av alla testade aPL visas i tabell 3. Totalt sett drabbades 169 patienter av graviditetsmorbiditet enligt APS-kriterierna och 41 (24 %) av dem uppvisade permanent positivitet för minst ett av de uppmätta aPL. Den högsta prevalensen hittades för aCL och aPS/PT (13 %) medan prevalensen för LA och anti-GPI var lägre (7 %) (tabell 3). Elva patienter (6,5 %) var positiva för aPS/PT samtidigt som de var negativa för alla andra testade aPL. Sex av dem hade återkommande aborter före 10:e WG, två upplevde en oförklarlig död av ett morfologiskt normalt foster efter 10:e WG, en födde för tidigt och två upplevde både återkommande aborter och för tidig födsel. Med hänsyn till Sydneys reviderade laboratoriekriterier för APS var 17,8 % (30/169) av patienterna positiva för LA eller aCL och/eller anti-GPI. Av dem behandlades 22 med lågmolekylärt heparin (LMWH) och lågdosaspirin (LDA), vilket resulterade i en lyckad graviditet. Sex kvinnor hade inga efterföljande graviditeter; tre av dem hade en lyckad graviditet före APS-graviditetskomplikationer. Två kvinnor hade misslyckade efterföljande singelgraviditeter trots antikoagulantiabehandling. När de adjungerade aPS/PT-resultaten avslöjade ytterligare 6,5 % (11/169) av patienterna med negativ graviditetsutgång som var positiva för aPL.

Frekvensen av aPL bland 42 patienter som upplevt mindre än tre missfall före 10:e WG (och som inte uppfyllde APS-klassificeringskriterierna) var mycket låg och uppvisade inga skillnader jämfört med friska kvinnor.

Statistiska analyser kunde inte finna något samband mellan att högre nivåer av aPL var starkare associerat med ogynnsamma graviditetsresultat.

När man analyserade var och en av de tre kategorierna av graviditetsmorbiditet som ingår i APS-klassificeringskriterierna var endast aPS/PT-antikroppar statistiskt signifikant förknippade med någon av de tre typerna av ogynnsamt graviditetsutfall (, åldersjusterat) (tabell 4). Faktum är att dessa är de enda aPL med signifikant högre frekvens hos patienter som upplever återkommande aborter före 10:e WG jämfört med friska kvinnor. Anti-GPI-antikroppar visade däremot inget samband med någon typ av graviditetsmorbiditet. aCL och LA var förknippade med obstetriska komplikationer som uppträdde sent under graviditeten; de visade dock inget samband med tidig graviditetsmorbiditet.

Åldersjusterade analyser utfördes för att skatta den relativa risken för positivt utfall i olika aPL-tester (LA, aCL, anti-GPI och aPS/PT) till obstetriska komplikationer som är karakteristiska för APS presenterade som OR med 95 % konfidensintervall. Som framgår av tabell 5 var det endast aCL- och aPS/PT-antikroppar som uppvisade en förhöjd risk för obstetriska komplikationer (OR 7,4 respektive OR 7,4).

I vår grupp av 169 patienter hade 12 (6 %) en anamnes på trombos och prevalensen av alla testade aPL var högre bland dem jämfört med friska kontroller (). Att utesluta dessa 12 patienter från logistiska regressionsanalyser visade att frekvenser av aCL- och aPS/PT-antikroppar fortfarande var signifikant högre jämfört med friska kontroller ( respektive ,).

4. Diskussion

Vidare flera studier utvärderade aPL-positivitet hos APS-patienter med trombosanamnes är det endast ett fåtal studier som etablerat ett samband mellan olika aPL och enskilda obstetriska abnormiteter som är utmärkande för APS. Frågan uppstår om samma profil av aPL förekommer hos APS-patienter med en historia av trombos jämfört med obstetrisk APS. Det råder allmän enighet om att man bör undersöka LA, aCL och anti-GPI, men betydelsen av andra autoantikroppar är fortfarande kontroversiell. Därför föreslogs nödvändigheten av att utföra fler kohortstudier för att fastställa incidensen av icke-kriterier aPL vid graviditetsförlust . Sedan dess har vår grupp fokuserat på att utvärdera prevalensen av aPS/PT-antikroppar bland kvinnliga patienter som drabbats av olika obstetriska komplikationer under sin graviditet.

Vi fann en total prevalens av aPS/PT på 13,0 %, aCL på 12,4 %, LA och anti-GPI på mindre än 8,0 % i vår grupp patienter med obstetriska komplikationer som är karakteristiska för APS. Både aPS/PT och aCL var betydligt vanligare i vår kohort av patienter jämfört med friska blodgivare. aCL korrelerade dock endast med sen graviditetsmorbiditet och prematuritet medan aPS/PT var de enda antikropparna som var associerade med tidig återkommande graviditetsförlust samt med sen graviditetsmorbiditet och prematuritet. Våra resultat är i linje med Clark et al. som föreslog att aCL-associerad tidig återkommande graviditetsförlust skulle tas bort från klassificeringskriterierna på grund av den inkonsekventa prevalensen av aCL i denna population och en ökande mängd bevis pekar på det faktum att denna kliniska manifestation av APS skiljer sig från sen förlust eller tidig förlossning med placentainfarkt. Enligt våra resultat kan det dock vara fördelaktigt att fastställa aPS/PT i samband med tidig återkommande graviditetsförlust. Vi fann att 7 % (11/169) av patienterna var aPS/PT-positiva och negativa för alla andra testade aPL och 63 % (7/11) av dem upplevde tidig återkommande graviditetsförlust. Endast en publicerad studie bekräftade också sambandet mellan antiprotrombinantikroppar och tidig graviditetsförlust; den skilde sig dock från den aktuella studien genom att de mätte aPT-A och inkluderade patienter vars graviditeter avslutades spontant inom 20 WG . Med hänsyn till Sydneys reviderade laboratoriekriterier för APS var endast 17,8 % (30/169) av patienterna i vår studie positiva för LA eller aCL och/eller anti-GPI, men när aPS/PT utvärderades som en ytterligare parameter var 24,8 % (41/169) av patienterna aPL-positiva.

Vi har också fastställt frekvensen av aPL hos 42 patienter som upplevde färre än tre missfall före 10:e WG och som inte uppfyllde klassificeringskriterierna för APS. I linje med våra förväntningar var prevalensen av alla aPL i denna grupp mycket låg (<7 %) och skilde sig inte från frekvenser som hittats hos friska kvinnor.

Litteraturgenomgången avslöjade 12 studier daterade från 1997 till 2013. Mer än hälften av artiklarna publicerades före 2006, då nya reviderade klassificeringskriterier accepterades. Fem studier testade endast aPT-A-antikroppar, som (enligt nyare uppgifter) har mindre betydelse för APS . Av de fem större studierna, som rekryterade mer än 100 patienter, visade tre ett signifikant samband mellan aPS/PT eller aPT-A och obstetriska komplikationer; i en av studierna fann man inget signifikant samband, men man mätte endast aPT-A-antikroppar , och en av studierna utfördes före 2006 och rekryterade patienter med mer än två återkommande missfall, i stället för tre . Motstridiga uppgifter i litteraturen och bristen på studier som undersöker antiprotrombinantikropparnas roll vid obstetrisk APS ledde till att vi undersökte förekomsten av dessa antikroppar vid olika tidiga och sena negativa graviditetsutfall. Den totala prevalensen av aPS/PT-antikroppar i vår studie var 13,0 %. Denna siffra är högre än de som rapporterades av Andreoli et al. som granskade 120 studier som undersökte LA, aCL och anti-GPI och gav en total aPL-frekvens som uppskattades till 6 % för graviditetsmorbiditet. I sällsynta studier undersöktes den kliniska betydelsen av antiprotrombinantikroppar i förhållande till negativt obstetriskt utfall. Akimoto et al. fann att medeltitern av antiprothrombin-1-antikroppar hos patienter med spontana aborter var högre än hos normala gravida kvinnor. Senare studier har dock inte visat något samband mellan antiprotrombinantikroppar (aPT eller aPS/PT) och tidig återkommande graviditetsförlust . Bertolaccini et al. fann ett samband mellan aPS/PT och fosterdöd efter den tionde graviditetsveckan, men inte med tidig graviditetsförlust eller för tidig födsel. Marozio et al. rapporterade en positiv korrelation mellan aPT-A och negativa sena graviditetsutfall. I två nyligen genomförda studier fann man ett samband mellan aPS/PT och obstetriska avvikelser, men ingen av dem specificerade vilka typer av graviditetskomplikationer det rörde sig om.

Vår studie bekräftade inte sambandet mellan vare sig anti-GPI eller LA och något av de negativa utfallen av graviditeten. Detta är i linje med slutsatserna i den systematiska granskningen , vilket innebär att det för närvarande inte finns tillräckliga uppgifter för att fastställa något signifikant samband mellan anti-GPI och graviditetsmorbiditet. I Clark et al:s studie, som omfattade 2 257 kvinnor som besökte en klinik för högriskgraviditet, testade mindre än 1 % av patienterna med tidigt återkommande missfall positivt för LA, medan patienter som var positiva för LA å andra sidan hade en betydligt vanligare historia av trombos. Möjligen är LA och anti-GPI betydligt mer förknippade med trombotisk APS än obstetrisk APS, medan aCL och aPS/PT tycks vara förknippade med båda typerna av APS.

Den diagnostiska noggrannheten hos enskilda aPL för graviditetsförluster definierade enligt APS-klassificeringskriterierna, fastställd genom AUC, var låg och varierade mellan 0,499 för anti-GPI och 0,549 för aCL eller aPS/PT (tabell 5). I vår tidigare studie varierade AUC för olika aPL och APS (antingen trombotisk eller obstetrisk) från 0,88 för IgG aCL till 0,55 för IgM anti-GPI, medan Otomo et al. fastställde AUC (för de reviderade Sydney-kriterierna) till 0,688 . Vissa patienter med kliniska symtom som är signifikanta för APS och som uppfyller de kliniska kriterierna är negativa för alla testade aPL och inom denna grupp skulle aPS/PT trots lägre AUC kunna förbättra diagnoserna av APS genom att öka sensitiviteten för det totala aPL.

Hittills har mekanismen genom vilken antiprotrombinantikroppar kan vara inblandade i morbiditet under graviditet inte klarlagts. Det är dock mycket troligt att det finns fler möjliga vägar som är involverade. Det har föreslagits att de kan leda till graviditetsförlust genom att främja mikrovaskulär placentatrombos, vilket stöddes av histologiska fynd . Placentatrofoblasten är det viktigaste organet där fosfatidylserin är starkt exponerat på membranets yttre blad. Under embryonal och placentadifferentiering sker en störning av lipidasymmetrin, vilket leder till exponering av fosfatidylserin på den yttre ytan. Antiprotrombinantikroppar kan korslänka protrombin på cellytan där de kan komplicera graviditeten genom komplementaktivering eller genom att störa signaleringen, som enligt resultaten av in vivo-experimenten tycks vara en viktig faktor för sjukdomsmanifestationen. Ett ökat antal apoptotiska händelser av jätteceller i den fosfatidylserin-exponerade ektoplacentan observerades, vilket kan leda till otillräcklig utveckling av placentan, vilket resulterar i ett embryo som är litet för datum eller fosterförlust . Å andra sidan har det observerats att protrombin hos möss spelar en viktig roll i embryoutvecklingen och att brist på protrombin leder till embryonal och neonatal dödlighet . Det råder ingen tvekan om att det krävs ytterligare undersökningar för att klargöra de vägar i vilka antiprotrombinantikroppar är inblandade i APS:s patogenes, men det har ändå visats att patienter som behandlas för APS har goda graviditetsresultat . I en översikt av Marchetti et al. drogs slutsatsen att screening av APS-patienter med hög risk är nödvändig för att förbättra deras graviditetsutfall, och vi visade att screening av aPL-profilen inklusive aPS/PT, utöver LA, aCL och anti-GPI, skulle kunna möjliggöra en bättre utvärdering av APS-patienter med hög risk och möjligen förutsäga ytterligare graviditetsförluster. På samma sätt föreslog Ulcova-Gallova et al. att bestämning av aPL endast mot kardiolipin hos patienter med reproduktionsstörningar inte är tillräckligt för obstetrisk-gynekologisk diagnos; därför kan det vara motiverat att undersöka aPS/PT i denna patientgrupp.

5. Slutsats

aPS/PT är förknippade med negativt graviditetsutfall oberoende av andra antifosfolipidantikroppar. Därför kan aPS/PT-mätning förbättra utvärderingen av patienter med tidig återkommande graviditetsförlust som inte upptäcks av andra aPL-tester. Ytterligare studier med ett större antal patienter med graviditetskomplikationer och/eller reproduktionssvikt och till synes friska donatorer behövs för att fastställa de oberoende effekterna av olika antifosfolipidantikroppar samt aPS/PT och bekräfta deras potentiella användning i klinisk praxis.

Abkortningar

Intressekonflikter

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.

Acknowledgment

Detta arbete har stötts av Sloveniens ministerium för högre utbildning, vetenskap och teknik genom det nationella forskningsprogrammets bidrag (nr P3-0314).