Articles /

U.S. Food and Drug Administration

Manualul de analiză bacteriologică (BAM) Pagina principală

Autori: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett și Jennifer M. Hait

Historia revizuirilor:

  • Iunie 2017 – Noul capitol 13B a fost adăugat la Bacteriological Analytical Manual
  • Ianuarie 2018 – Hyperlink pentru CDC APHIS/CDC Formularul 4 corectat

Intoxicația alimentară cu stafilococ (SFP) este o intoxicație care rezultă din consumul de alimente contaminate cu niveluri adecvate de enterotoxine preformate. Simptomele SFP se manifestă în termen de 2-8 ore de la ingestie și includ greață, vărsături, crampe abdominale cu sau fără diaree, care se rezolvă de obicei în 24-48 de ore. (Argudin et al., 2010). Numărul de persoane afectate de SFP este doar o estimare din cauza diagnosticării greșite și a focarelor minore care nu sunt raportate. Spitalizarea este rară, dar a fost observată la persoanele care sunt imunocompromise, în special la persoanele în vârstă și foarte tinere (Scallan et al., 2011).

Stafilococii sunt prezenți în mod normal pe pielea umană și pe membranele mucoase cu aproximativ 20-30% pentru colonizarea persistentă și 60% pentru cea intermitentă (Kluytmans et al., 2005). Manipulatorii de alimente care sunt colonizați cu stafilococi enterotoxigeni sunt considerați a fi principala sursă de contaminare a alimentelor prin contactul direct cu produsele sau suprafețele de contact. Animalele, cum ar fi bovinele de lapte, pot fi, de asemenea, purtătoare de stafilococi și pot constitui o sursă de contaminare a laptelui și a produselor lactate. În cele din urmă, stafilococii prezenți în mediul înconjurător pot fi transferați la produsele alimentare servind ca sursă potențială de contaminare (Gutiérrez et al., 2012).

Alimentele asociate în mod obișnuit cu SFP includ alimentele procesate, carnea, carnea de pasăre, produsele lactate și produsele de panificație. Odată ce alimentele sunt contaminate, poate avea loc creșterea stafilocociilor și producerea de enterotoxine, în special dacă nu sunt respectate bunele condiții de fabricație care împiedică creșterea, cum ar fi condițiile de depozitare la frigider sau etapele de ucidere termică, cum ar fi pasteurizarea (Gutiérrez et al., 2012). Enterotoxinele stafilococice sunt stabile la căldură și nu se denaturează decât dacă sunt expuse la temperaturi ridicate pentru perioade lungi de timp, de ex, autoclavare la 121°C (250°F) la 15 PSI timp de 60 de minute (CDC, 2007).

Staphylococcus aureus este cel mai frecvent legat de focarele de intoxicații alimentare stafilococice, dar alți stafilococi coagulazopozitivi enterotoxigeni, cum ar fi S. hyicus și S. intermedius, au fost, de asemenea, implicați în focare (Hennekinne et al., 2010). Enterotoxinele stafilococice (SE) sunt exotoxine pirogene cu activitate superantigenă. Enterotoxinele sunt proteine globulare care sunt rezistente la căldură și la proteaze, cu o dimensiune moleculară în medie de aproximativ 25 kDa. Estimările privind cantitatea de toxină necesară pentru a provoca boala sunt foarte scăzute. Un focar legat de laptele cu ciocolată a detectat niveluri de SEA de 0,5ng/ml (Evenson et al., 1988) și 0,38ng/ml de SEA a fost detectat într-un focar legat de laptele praf (Asao, et al., 2003).

SSE clasice (SEA-SEE) și SE non-clasice, SEG, SEH, SEI, SER și SET au activitate emetică dovedită. Activitatea emetică pentru enterotoxinele SE-like SE SElJ-SElQ, SElS, SElU și SElV nu a fost încă demonstrată. Toate genele se și sel au fost localizate pe elemente genetice mobile, inclusiv bacteriofagi, insule de patogenitate, plasmide sau transpozoni (Argudin et al., 2012).

Detecția SE este de importanță capitală pentru siguranța alimentară și protecția aprovizionării cu alimente. Metodele de detectare a SE se bazează pe testele imunoenzimatice polivalente (ELISA) sau imunoenzimatice fluorescente (EFLA) disponibile în comerț cu anticorpi care detectează SEA-SEE. Metodele monovalente sunt specifice pentru SEA-SEE și pot fi utilizate pentru a distinge aceste tipuri. Metodele necesită extragerea enterotoxinei din alimentele suspecte înainte de analiză. Sensibilitatea și selectivitatea metodei sunt îmbunătățite prin concentrarea prin dializă a extractului alimentar, dar constrângerile de timp pot necesita teste preliminare fără concentrare. Cu toate acestea, concentrarea prin dializă trebuie efectuată pe toate produsele lactate înainte de analiză (Hennekinne et al., 2012).

ATENȚIE: Enterotoxinele stafilococice sunt foarte toxice, iar procedurile care pot crea aerosoli trebuie efectuate în cabină de securitate biologică (BSC) aprobată. Enterotoxinele stafilococice (SEA, SEB, SEC, SED și SEE) sunt agenți selectivi. Oamenii de știință trebuie să urmeze liniile directoare stabilite de CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Echipamente și materiale speciale
    1. Camera cu temperatură controlată sau frigider 2-8°C.
    2. Blender sau omogenizator.
    3. Incubator 35-37°C.
    4. Balanță analitică și cântărire.
    5. Tablă pentru dializă.
    6. Metru de pH. pH-ul din timpul extracției și pH-ul tampoanelor utilizate în extracție sunt importante. Efectuați ajustări în limita a ± 0,1 unități de pH.
    7. Centrifugă refrigerată la 2-8°C.
    8. Materie de laborator din sticlă sau polipropilenă pentru a evita adsorbția toxinelor.
    9. Se utilizează pânză de filtru pentru a colecta resturile după centrifugare. Adesea, se folosesc mai multe straturi de pânză de mestecat grosieră umezită în prealabil pentru a îndeplini această sarcină.
    10. Embutelie de separare.
    11. Membrană de dializă MWCO 6.000-8.000 Daltoni (de exemplu, Spectra/Por® cu închizători) lățime plană 23 ± 2 mm.
    12. Dispozitive de filtrare cu tuburi conice sub vid (membrană de 0,22µm), cum ar fi Steriflip (EMD Millipore), recomandate pentru filtrarea supernatantelor de culturi lichide ca măsură de siguranță pentru a evita aerosolizarea enterotoxinelor.
    13. Cabinet de securitate biologică.
  2. Reactivi

    Nota: producătorii de kituri pot necesita tampoane sau solvenți diferiți.

    1. Soluție salină tamponată cu fosfat (soluție PBS) pH 7,3 + 0,2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) pentru a prepara 1L PBS se dizolvă 9 g NaCl și 3,58 g Na2HPO4 în 1L apă distilată. Se ajustează pH-ul la 7,2 ± 0,2 folosind HCl.
    2. Clorură de sodiu (NaCl).
    3. Fosfat de sodiu (Na2HPO4).
    4. Polietilenglicol (PEG) (20.000 mol wt) Se prepară o soluție de 30% (w/v) de PEG prin adăugarea a 30 g de PEG pentru fiecare 70 ml de apă distilată.
    5. 1 N (sau 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (sau 0,1 N) HCl.
  3. Pregătirea membranei de dializă
    Se taie membrana de dializă suficient de lungă pentru a acomoda extractul alimentar care urmează să fie concentrat. Se înmoaie tubulatura în 2 schimburi de apă distilată pentru a îndepărta stratul de glicerină. Se folosește o membrană de închidere sau se leagă un capăt al tubului cu 2 noduri apropiate. Se umple tubul cu apă distilată și se testează dacă există scurgeri prin stoarcerea sacului umplut în timp ce se ține bine închis capătul deschis. Goliți sacul și puneți-l în apă distilată până la utilizare.
  4. Extracția enterotoxinei din porțiuni de alimente

    NOTA: această procedură și alte proceduri care pot genera aerosoli de microorganisme patogene sau enterotoxine trebuie efectuate într-o cabină de biosecuritate aprobată.

    1. Dacă este posibil, măcinați întregul produs alimentar sau porțiuni din selecții reprezentative ale produsului într-un blender pentru a omogeniza proba astfel încât orice SE prezent în alimente să fie distribuit uniform.
      1. Pentru brânzeturile cu crustă, luați o probă de brânză cu 10% crustă și 90% brânză.
      2. Pentru produsele uscate, folosiți cantități egale de apă cu produsul pentru a le amesteca sau urmați instrucțiunile producătorului.
    2. Cântăriți 25 g de probă într-un pahar de sticlă și transferați porțiunea de test într-un blender cu 40 ml de apă distilată și amestecați la viteză mare timp de 3 minute, generând o suspensie omogenizată. Nu adăugați apă la probele lichide, ci treceți la pasul 3.
    3. Lăsați toxina să se difuzeze prin agitarea probei la temperatura camerei timp de 30 de minute.
    4. Acidificați amestecul cu HCl 0,1N până la un pH între 3,5 și 4,0. Notă: dacă pH-ul scade sub 3,0 trebuie pregătită o altă porție de 25 g.
    5. Transferați suspensia acidificată în tuburi conice de propilenă de 50 ml. Centrifugați la 3.130 × g timp de 20 min la 5°C. Se pot folosi viteze mai mici cu un timp de centrifugare mai lung, dar limpezirea unor alimente nu este la fel de eficientă. Separarea materiilor grase este ineficientă dacă alimentele nu sunt centrifugate la temperatură refrigerată.
    6. Decantați lichidul supernatant în paharul de 800 ml prin pânză de mestecat sau alt material filtrant adecvat plasat într-o pâlnie de separare. Dacă supernatantul nu este limpede, centrifugați din nou și decantați lichidul prin pânză de mestecat. Se testează pH-ul, care trebuie să fie între 3,5 și 4,5. Dacă pH-ul este corect, neutralizați amestecul cu NaOH 0,1N pentru a obține un pH între 7,4 și 7,6.
    7. Dacă pH-ul este >4,5 repetați acidificarea, dar dacă <3,0 sau=””>9,0 repetați procesul cu o altă porție de 25 g de aliment.
    8. În cazul în care există o cantitate suficientă de probă disponibilă pentru repetarea testelor, poate fi prelevată o alicotă pentru depistare cu ajutorul unui test validat (a se vedea sec. H). Dacă rezultatele screeningului sunt negative, extractul rămas trebuie concentrat prin dializă și testat din nou.
  5. Concentrarea prin dializă a extractului
    1. Puneți extractul în sacul de dializă pregătit. Așezați sacul închis într-o tavă și scufundați sacul în PEG 30% (p/v). Țineți la 5°C până când volumul se reduce la 15-20 ml sau mai puțin. Acest proces poate dura 24-72 de ore, dar dacă volumul nu se reduce după ce se menține peste noapte, adăugați PEG sub formă de pulbere în tavă. Scoateți sacul din PEG și spălați bine exteriorul cu apă pentru a îndepărta orice PEG care a aderat la sac. Se înmoaie în apă distilată timp de 1-2 minute. Turnați conținutul în paharul mic.
    2. Rezolvați interiorul sacului cu 2-3 ml de apă distilată (pentru lapte și produse lactate se folosește PBS), trecând degetele în sus și în jos pe exteriorul sacului pentru a îndepărta materialul care aderă la părțile laterale ale tubului. Repetați clătirea până când lichidul de clătire este limpede. Păstrați volumul cât mai mic posibil.
    3. Ajustați pH-ul extractului la 7,4-7,6.
    4. Extractele concentrate trebuie analizate în termen de 48 de ore și depozitate la 3-5°C, în caz contrar, congelați extractele la 18-20°C și dezghețați-le complet la 3-5°C înainte de testare. Unele teste, cum ar fi Vidas SET2, necesită o analiză imediată.
  6. Testarea SE din culturi bacteriene

    Stafilococii stafilococici suspectați de producerea de enterotoxine pot fi îmbogățiți în prealabil în bulion nutritiv, cum ar fi TSB sau BHI.

    1. Transferați două sau trei colonii morfologic similare în 10 ml de bulion nutritiv.
    2. Incubați la 35-37°C peste noapte pe un agitator orbital.
    3. Centrifugați culturile 5 minute 3500 × g la 10°C
    4. Filtrați supernatantul folosind un dispozitiv de filtrare în vid Steri-Flip cu un filtru de 0,22µm sau un alt sistem închis pentru a evita aerosolizarea enterotoxinelor. Această procedură trebuie efectuată într-o cabină de securitate biologică pentru a asigura siguranța cercetătorului.
    5. Supernatanții de cultură pot avea niveluri ridicate de SE care se află în afara intervalului liniar al kitului, putând necesita diluție cu PBS.
  7. Raportarea rezultatelor

    Prezența enterotoxinei stafilococice detectate în produsele alimentare trebuie raportată la Programul federal pentru agenți selectivi gestionat de Centrul pentru controlul și protecția bolilor (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.html prin completarea formularului APHIS/CDC 4.

    Rezultatele pozitive se raportează ca entertoxoină stafilococică detectată în × g (ml) de produs. Rezultatele negative se raportează ca enterotoxină stafilococică nedepistată în × g (ml) de produs.

  8. Note

    Kit-ul trebuie să fie capabil să detecteze enterotoxina la nivelul minim de 0,05ng/g cu niveluri ridicate de sensibilitate relativă (>90%) și specificitate relativă (>90%).

    Menționarea denumirilor comerciale sau a produselor comerciale în cadrul metodei se face exclusiv în scopul informării științifice și nu implică recomandarea sau aprobarea de către Administrația pentru Alimente și Medicamente a Statelor Unite. Două metode care sunt utilizate în mod obișnuit pentru detectarea SE includ Vidas SET2 (bioMerieux, Inc.), aprobat de AOAC, care este un test fluorescent enzimatic polivalent automatizat (EFLA) care detectează SEA-SEE (AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010). Numărul de catalog actual pentru Vidas Set2 este Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) este un imunodozator enzimatic manual realizat în godeuri acoperite cu anticorpi polivalenți. Kitul polivalent Ridascreen detectează enterotoxinele stafilococice SEA-SEE și a fost validat și verificat prin încercări inelare și studii de validare de terță parte conduse de Laboratorul de referință al Uniunii Europene pentru stafilococi coagulazo-pozitivi pentru mandatul Comitetului European de Standardizare (CEN) propus de standardul ISO 19020. Este disponibil un kit monovalent Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG), dar acest kit nu a fost validat printr-o terță parte. Numărul de catalog pentru kitul polivalent Set Total este R4105 (96 de teste) sau R4106 (48 de teste) . Numărul de catalog pentru kitul monovalent SET A,B,C,D,E este R4101.

Interferențe

Reacțiile nespecifice pot apărea în produsele alimentare care au enzime endogene cum ar fi lactoperoxidaza sau fosfataza alcalină și pot interfera cu kituri cum ar fi Vidas SET2 care utilizează fosfataza alcalină ca enzimă de detecție (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Se recomandă ca toate rezultatele pozitive să fie confirmate cu o metodă alternativă care utilizează o enzimă de detecție diferită. În cazul Vidas SET2, o metodă alternativă este Ridascreen SET Total care utilizează lactoperoxidază.

Se poate aplica un tratament termic pentru a elimina fosfataza alcalină endogenă din probă, după cum urmează:

  • Transferați 600 μL de extract concentrat într-un tub
  • Încălziți la 80°C timp de 2 minute
  • Repetați testul Vidas SET2 cu concentratul răcit. Se poate produce o oarecare pierdere de enterotoxină.

Dacă se suspectează un rezultat inexact folosind Ridascreen sau alt kit care utilizează lactoperoxidază, transferați 100 μL de extract concentrat într-un tub. Adăugați câte 50μL din soluțiile de substrat și de kit cromagen. Se amestecă și se urmărește obținerea unei culori albastru-verzui. În cazul în care apare culoarea verde-albastră, aceasta indică faptul că lactoperoxidaza intrinsecă este prezentă în probă și a interferat cu testul. Prin urmare, trebuie utilizată o altă metodă de detecție.

  1. Argudin, MA, Mendoza, MC, și Rodicio MR. Intoxicațiile alimentare și enterotoxinele Staphylococcus aureus. Toxins 2010, 2, 1751-1773.
  2. Argudin, MA, Mendoza, MC, Gonzáalez-Hevia, MA, Bances, M, Guerra, B, și Rodicio MR. Genotipuri, conținut de gene de exotoxină și rezistență antimicrobiană a tulpinilor de Staphylococcus aureus recuperate din alimente și manipulatori de alimente. AEM 2012 78 2930-2935.
  3. Asao, T, Kumeda, Y, Kawai, T, Shibata, T, Oda, H, Nakazawa, H, și Lozaki, S. An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: estimate of of entertoxin A in the incriminated milk and powdered skim milk. Epidemiol. Infect., 2003, 130, 33-40.
  4. Centers for Disease Control/National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (Securitate biologică în laboratoarele microbiologice și biomedicale). Ediția a cincea, 2007, Evenson, ML, Hinds, MW, Bernstein, RS, Befgdoll, MS. Estimarea dozei umane de enterotoxină stafilococică A dintr-un mare focar de intoxicație alimentară stafilococică cu lapte cu ciocolată. Int J Food Microbiol 1988, 31, 311-316.
  5. Gutiérrez, D, Delgado, S, Vázquez-Sánchez, D, Martinez, B, Caba, ML, Rodriguez, A, Herrera, JJ, și Garcia, P. Incidența Staphylococcus aureus și analiza comunităților bacteriene asociate pe suprafețele din industria alimentară. AEM 2012, 78, 8547-8554.
  6. Hennekinne, JA, Ostyn, A, Fuillier, F, Hervin, S, Prufer, AL, și Dragacci, S. How Should Staphylococcal Food Poisoning Outbreaks be Characterized? Toxins, 2010, 2, 2106-2116.
  7. Hennekinne, JA, De Buyser, MA, și Dragacci, S. Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins: characterization and outbreak investigation. FEMS Microbiol Rev, 2012, 36, 815-836.
  8. Kluytmans, JAJW, și Wertheim, HFL. Transportul nazal de Staphylococcus aureus și prevenirea infecțiilor nosocomiale. Infection 2005, 33, 3-8.
  9. Scallan E, Hoekstra RM, Angulo FJ, Tauxe RV, Widdowson M-A, Roy SL, et al. Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Infectologie de urgență. Dis. 2011 Jan. http://www.cdc.gov/EID/content/17/1/7.htm
  10. Vernozy-Rozand, C., Mazuy-Cruchaudet, C., Bavai, C. și Richard, Y. (2004), Comparison of three immunological methods for detecting staphylococcal enterotoxins from food. Lett App Microbiol, 2004, 39, 490-494 . doi:10.1111/j.1472-765X.2004.01602.x

.

Leave a Reply