Testul de permeabilitate Caco-2

Întrebări și răspunsuri despre permeabilitatea Caco-2

Vă rugăm să oferiți o prezentare generală a testului de permeabilitate Caco-2 de la Cyprotex.

Celele Caco-2 sunt utilizate pe scară largă ca model in vitro pentru a prezice absorbția medicamentelor la om. Linia celulară Caco-2 este derivată dintr-un carcinom colorectal uman, iar atunci când sunt cultivate, celulele se diferențiază spontan în monostraturi de enterocite polarizate.

Celele sunt însămânțate pe plăci cu inserție multiplă de puțuri și formează un monostrat confluent în decurs de 20 de zile înainte de experiment. În ziua 20, se adaugă compusul de testare pe partea apicală a membranei și se monitorizează fluxul compusului prin monostrat pe o perioadă de timp de 2 ore. Pentru a studia efluxul de medicament, este necesar, de asemenea, să se investigheze transportul compusului din compartimentul bazolateral în compartimentul apical.

Coreficientul de permeabilitate (Papp) se calculează din următoarea ecuație:

Unde dQ/dt este rata de permeabilitate a medicamentului prin celule, C0 este concentrația donatorului la momentul zero și A este aria monostratului celular.

Cum se interpretează datele din testul de permeabilitate Caco-2?

Există mai multe moduri în care pot fi utilizate datele din testul de permeabilitate Caco-2. În primul rând, compușii pot fi clasificați în funcție de valorile lor Papp. Doi compuși de referință, atenolol (transport paracelular pasiv) și propranolol (transport transcelular pasiv) sunt analizați alături de compușii de testare. Atenololul și propranololul au o absorbție umană cunoscută de 50 % și, respectiv, 90 %2,3 și pot fi utilizate ca markeri pentru clasificarea compușilor de testare. În al doilea rând, datele pot fi utilizate împreună cu alți parametri in vitro pentru a prezice farmacocinetica orală a unui compus in vivo cu ajutorul software-ului de simulare Cloe PK. În al treilea rând, datele Caco-2 pot fi utilizate pentru a prezice permeabilitatea barierei hemato-encefalice (BBB) (figura 3).

Figura 3
Corelația dintre Pactive derivat din Caco-2 ((PappB-A – PappA-B)/2) și rata de permeabilitate a BBB in situ, logPS (produsul permeabilitate-arie de suprafață). Medicamentele despre care se știe că permeabilizează BBB (cafeină, imipramină, progesteron) au logPS >-2,0 (zona umbrită verde), în timp ce medicamentele despre care se știe că nu traversează BBB (aldosteron, hidrocortizon, cimetidină) au un logPS ≤-3,5 (zona umbrită roz).

Este prezentată o linie de regresie care arată o corelație clară între Pactive și logPS pentru compușii care nu sunt supuși unor niveluri semnificative de activitate de eflux în celulele Caco-2, adică, pentru compușii cu un Pactive de < 5 × 10 -6 cm/s. Utilizând această corelație, testul Caco-2 de la Cyprotex poate fi utilizat pentru a evalua potențialul BBB pentru compușii cu Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.

Care este relația dintre permeabilitatea Caco-2 și absorbția intestinală umană?

Relația dintre permeabilitatea Caco-2 (utilizând tampoane HBSS pH7,4 atât în compartimentul apical, cât și în cel bazolateral) și absorbția intestinală umană este prezentată în figura 4. Această corelație este tipică pentru cele observate în literatura de specialitate pentru acești doi parametri4. Este important de remarcat faptul că acest grafic este influențat de acuratețea datelor de absorbție intestinală. Valorile absorbției intestinale utilizate în acest grafic sunt preluate din Zhao et al. 20012. În această lucrare, absorbția intestinală umană a fost extrasă din diverse surse și variază considerabil în ceea ce privește calitatea. Se știe, de asemenea, că mai mulți compuși prezintă o absorbție dependentă de doză (prezentată prin barele de eroare de pe grafic).

Figura 4
Relația dintre permeabilitatea Caco-2 și absorbția intestinală umană %.

Care sunt diferențele dintre testul de permeabilitate PAMPA și testul de permeabilitate Caco-2?

Se consideră că testul de permeabilitate Caco-2 este mai reprezentativ pentru absorbția umană in vivo decât PAMPA (testul de permeabilitate cu membrane artificiale paralele). PAMPA oferă doar o măsură a difuziei pasive, în timp ce modelul Caco-2 oferă o mai bună predicție a absorbției umane pentru compușii care prezintă absorbție sau eflux activ sau care trec prin membrană pe cale paracelulară. Informațiile din ambele teste utilizate împreună pot fi valoroase în identificarea cauzei principale a absorbției slabe.

Cum se măsoară efluxul medicamentului?

Se efectuează un test de permeabilitate Caco-2 bidirecțional în care se măsoară transportul compusului în direcția apicală spre bazolaterală, precum și în direcția bazolaterală spre apicală. Rezultatul se raportează de obicei sub forma unui raport de eflux, adică Papp(B-A)/Papp(A-B). În cazul în care raportul de eflux este mai mare de doi, acest lucru indică faptul că are loc un eflux de medicament. Talinololul, un substrat cunoscut al P-gp, este analizat ca un compus de control pentru a confirma că celulele exprimă proteine transportoare de eflux funcționale.

Cum știți dacă celulele au format un monostrat confluent?

Măsurarea rezistenței electrice transepiteliale (TEER) este utilizată pentru a determina formarea unei joncțiuni strânse între celule. În plus, galbenul lucifer, un marker de integritate a membranei, este co-incubat cu compusul de testare la începutul experimentului. În cazul în care Papp a galbenului lucifer depășește 1,0 × 10 -6 cm/s într-un puț, dar rezultatul Papp derivat pentru compusul testat sau pentru compusul de control în acel puț este calitativ similar cu cel determinat în puțul (puțurile) replicat(e) rămas(e) (în limitele pragului galbenului lucifer), atunci, pe baza aprecierii științifice a cercetătorului responsabil, monostratului celular poate fi considerat acceptabil. În caz contrar, se exclude rezultatul din monostrat afectat și se raportează un rezultat n=1 sau compusul poate fi testat din nou. În cazul în care ambele repetiții sunt afectate, atunci compusul este supus unei noi examinări. Dacă ambele valori Papp de galben lucifer eșuează pentru același compus în două ocazii diferite, atunci se presupune că compusul prezintă fie efecte citotoxice împotriva celulelor Caco-2, fie o fluorescență inerentă.

Cum și de ce se calculează % de recuperare?

Ce % de recuperare poate fi util în interpretarea datelor Caco-2. Dacă recuperarea este foarte scăzută, acest lucru poate indica probleme legate de solubilitatea slabă, de legarea compusului de placă, de metabolizarea de către celulele Caco-2 sau de acumularea compusului în monostrat celular.

.