Perle de alginat de calciu și alginat de calciu-chitosan care conțin celecoxib solubilizat într-o fază autoemulsifiantă
Abstract
În această lucrare au fost dezvoltate perle de alginat și alginat-chitosan care conțin celecoxib solubilizat într-o fază autoemulsifiantă, în scopul obținerii unui sistem de eliberare a medicamentului pentru administrare orală, capabil să întârzie eliberarea medicamentului în mediu acid și să o favorizeze în compartimentul intestinal. Raționamentul acestei lucrări a fost legat de dorința de a îmbunătăți eficacitatea terapeutică a celecoxibului reducând efectele adverse gastrice și de a favoriza utilizarea acestuia în profilaxia cancerului de colon și ca adjuvant în terapia polipozei familiale. Sistemele au fost preparate prin gelifiere ionotropă folosind ace cu diametre diferite (400 și 600 μm). Au fost investigate morfologia, dimensiunea particulelor, comportamentul de umflare și performanța de eliberare a medicamentului in vitro a perlelor în medii apoase cu pH diferit. Rezultatele experimentale au demonstrat că prezența chitosanului în formulare a determinat o creștere a rezistenței mecanice a structurii perlelor și, ca urmare, o limitare a capacității de umflare a perlelor și o scădere a ratei de eliberare a medicamentului la pH neutru. Perlele de alginat-chitosan ar putea fi un bun instrument pentru a garanta o eliberare a celecoxibului în colon.
1. Introducere
Sistemele de eliberare a medicamentelor care conțin polimeri naturali biodegradabili fac obiectul a tot mai multe studii de cercetare având în vedere avantajele pe care aceste materiale le pot oferi . Dintre acestea, cele care conțin alginat și chitosan au fost exploatate pe scară largă în domeniul farmaceutic .
Alginatul este un biopolimer natural solubil în apă extras din alge brune și compus din blocuri alternante de 1-4 resturi de acid α-L-guluronic și β-D-mannuronic . Acest polimer formează hidrogeluri în prezența cationilor divalenți, cum ar fi Ca2+, Ba2+, Sr2+ și Zn2+, iar această caracteristică permite prepararea de bile încărcate cu medicamente . Mecanismul acestui proces de gelifiere implică reziduuri guluronice cu chelarea specifică a Ca2+, formând așa-numita structură de tip „egg-box” . Mulți cercetători și-au concentrat atenția asupra dezvoltării perlelor de alginat de calciu ca sisteme de eliberare controlată a medicamentelor pentru administrarea pe cale orală a moleculelor de medicamente și a proteinelor .
Chitosanul este o polizaharidă liniară biocompatibilă, biodegradabilă, netoxică, compusă din unități de D-glucozamină și N-acetil-D-glucozamină legate prin legături β-(1-4) glicozidice . Chitosanul poate fi derivat prin deacetilarea parțială a chitinei din cochiliile de crustacee și este utilizat pe scară largă pentru cultura celulară, administrarea de medicamente și aditivi alimentari .
Legatura încrucișată a alginatului și chitosanului într-un hidrogel este utilizată pentru a furniza materiale utile pentru aplicații medicale și farmaceutice; sistemele obținute sunt caracterizate de o stabilitate sporită în comparație cu cele obținute cu un singur polimer . În eliberarea controlată a medicamentelor, complexul de polielectroliți alginat-chitosan a primit multă atenție în ultimii ani . Cei doi polimeri formează complexul polielectrolitic prin interacțiunea ionică dintre reziduurile carboxilice ale alginatului și reziduurile amino ale chitosanului. Perlele de alginat-chitosan pot fi produse prin diferite metode: procedura în două etape și procedura într-o singură etapă. În prima, perlele de gel de alginat de calciu sunt produse prin aruncarea unei soluții de alginat într-o baie de gelifiere care conține ioni de calciu. Sferele rezultate sunt apoi transferate într-o soluție de chitosan pentru a forma membrana pe suprafața lor. Procedura într-o singură etapă necesită ca picăturile de soluție de alginat să cadă într-o soluție apoasă care conține atât agentul de gelificare pentru alginat (de exemplu, ioni de calciu), cât și chitosan . Alegerea metodei de producție este responsabilă de proprietățile perlelor din cauza cantității de chitosan legat în produsul rezultat. În același timp, caracteristicile perlelor sunt influențate de greutatea moleculară a polimerilor selectați și/sau de procentajele diferitelor reziduuri din moleculele polimerice .
Celecoxibul, un derivat fluorat de benzensulfonamidă, este un medicament antiinflamator nesteroidian (AINS) cu o acțiune inhibitoare foarte selectivă a ciclooxigenazei-2 (COX-2). Acesta posedă activități antiinflamatoare, analgezice și antipiretice datorate inhibării sintezei prostaglandinelor catalizată de COX-2. Recent, acest medicament a fost investigat frecvent pentru activitatea sa anticancerigenă folosind modele in vitro și in vivo . Studiile preclinice asupra celecoxibului au raportat o activitate anticancerigenă proeminentă împotriva carcinomului cu celule scuamoase la nivelul capului și gâtului, cancerului de colon, cancerului de sân și cancerului pulmonar .
În această lucrare au fost dezvoltate perle de alginat și alginat-chitosan care conțin celecoxib solubilizat într-o fază autoemulsionantă pentru a obține un sistem de eliberare a medicamentului pentru administrare orală, capabil să întârzie eliberarea medicamentului în mediu acid și să o favorizeze în compartimentul intestinal. Raționamentul acestei lucrări a fost legat de dorința de a îmbunătăți eficacitatea terapeutică a celecoxibului reducând efectele adverse gastrice și de a favoriza utilizarea acestuia în profilaxia cancerului de colon și ca adjuvant în terapia polipozei familiale . Scopul studiului actual a fost evaluarea și compararea proprietăților perlelor de alginat de calciu și alginat de calciu-chitosan încărcate cu celecoxib. Au fost investigate morfologia, dimensiunea particulelor, comportamentul de umflare și performanța de eliberare a medicamentului in vitro a perlelor în medii apoase cu pH diferit.
2. Materiale și metode
2.1. Materiale
Celecoxibul a fost obținut de la Chemos GmbH (Regenstauf, Germania). Clorura de calciu anhidră și alginatul de sodiu (greutate moleculară 120000-190000 g/mol; raport de 1,56 reziduuri mannuronice-guluronice) au fost achiziționate de la Sigma Aldrich (Milano, Italia), în timp ce chitosanul cu greutate moleculară mică a fost achiziționat de la Fluka (Milano, Italia). Labrasol (caprilocaproil macrogol-8 gliceride) a fost un cadou de la Gattefossè (Milano, Italia); TPGS (D-α-tocoferil polietilenglicol 1000 succinat) a fost donat cu amabilitate de Isochem (Gennevillers, Franța). Toate celelalte substanțe chimice au fost de calitate analitică.
2.2. Prepararea perlelor de alginat de calciu
Perlele de alginat de calciu au fost preparate prin metoda de gelifiere folosind ioni de calciu ca agent de reticulare. În detaliu, o soluție apoasă de alginat de sodiu de 1,5% (g/g) a fost amestecată cu o fază autoemulsionantă încărcată cu medicament în proporție de 4 : 1 și adăugată picătură cu picătură la o soluție de 100 mM CaCl2 . Faza autoemulsifiantă a fost preparată prin amestecarea unor cantități cântărite de Labrasol și TPGS la 50°C și dizolvarea celecoxibului în soluția de excipient. Emulsia (soluție de alginat de sodiu și faza autoemulsionantă) a fost extrudată manual în baia de întărire prin ace cu diametrul interior de 400 sau 600 μm, sub agitare ușoară constantă, la temperatura camerei. După 15 minute, bilele au fost colectate, spălate cu apă deionizată pentru a elimina excesul de ioni de calciu și apoi uscate la 40°C peste noapte. Compoziția formulărilor preparate, codificate CAl 600 și CAl 400, a fost prezentată în tabelul 1.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Prepararea perlelor de alginat de calciu-chitosan
Perlele de alginat de calciu-chitosan (identificate ca CAlCh 600 și CAlCh 400) au fost preparate conform metodei într-o singură etapă. Procedura a fost identică cu cea adoptată în cazul bilelor de alginat, cu excepția faptului că baia de întărire a fost o soluție de chitosan de 0,2% (g/g) în acid acetic diluat (1%) conținând CaCl2 la o concentrație de 100 mM. Compoziția formulărilor de chitosan a fost raportată în tabelul 1.
2.4. Analiza morfologică și a dimensiunii particulelor
Morfologia mărgelelor umede și uscate și dimensiunea particulelor mărgelelor uscate au fost analizate cu ajutorul unui stereomicroscop Motic SMZ168 și a unui software de analiză a imaginilor (Motic Image Plus 2.0). Pentru fiecare formulare, dimensiunea particulelor a fost calculată ca valoare medie a dimensiunii a 20 de particule uscate.
2.5. Conținutul de medicament
Sase miligrame de bile uscate încărcate cu medicament au fost solubilizate în soluție tampon de fosfat (100 ml) la pH 6,8 la care s-a adăugat 0,75% (p/v) laurilsulfat de sodiu la 70°C sub agitare timp de două ore. După răcire, soluțiile obținute au fost filtrate și analizate spectrofotometric la 255 nm; rezultatele reprezintă media a cel puțin trei determinări.
2.6. Studiul de umflare
Studiile de umflare au fost efectuate la 37°C pe bile uscate introduse în trei medii apoase caracterizate prin pH-uri diferite: acid clorhidric la pH 1,0 și tampon de fosfat la pH 6,8 și pH 7,4.
Cantități precis cântărite de perle uscate de alginat de calciu și alginat de calciu-chitosan au fost introduse în flacoane de sticlă conținând 5 ml din fiecare lichid. După intervale de timp fixe (5, 15, 30, 60 și 120 de minute), probele au fost recuperate, șterse ușor cu hârtie și cântărite din nou. Schimbarea dinamică a greutății bilelor în funcție de timp, definită ca grad de umflare (Sw), a fost calculată conform următoarei ecuații: unde este greutatea bilelor în stare umflată la momentul respectiv și este greutatea inițială a bilelor uscate .
2.7. Studiul de eliberare a celebrecoxibului
Studiile de eliberare in vitro au fost efectuate în acid clorhidric la pH 1,0 și în tampon fosfat la pH 6,8, iar la pH 7,4 s-a adăugat 0,75% laurilsulfat de sodiu pentru a garanta menținerea condițiilor de afundare. Studiile au fost efectuate prin plasarea unor cantități cântărite cu exactitate din fiecare formulare, echivalente cu 8 mg de celecoxib, în 500 ml din lichidul selectat, la 37°C, la o viteză de rotație de 100 rpm (aparatul 2, paletă). Probele filtrate au fost prelevate la intervale de timp specifice, fără a fi înlocuite, și au fost analizate pentru determinarea conținutului de celecoxib cu ajutorul unui spectrofotometru UV la 255 nm atunci când lichidul era HCl și tampon de fosfat la pH 6,8 sau la 256 nm în cazul tamponului de fosfat la pH 7,4. Fiecare experiment a fost realizat în triplu exemplar.
Performanțele de eliberare a medicamentului de către alginatul de calciu și perlele de alginat de calciu-chitosan au fost comparate folosind parametrii de dizolvare t10%, t50% și t90% care indică punctele de timp la care au fost eliberate 10%, 50% și 90% din medicament și parametrul de similaritate f2 . Pentru ca curbele să fie considerate similare, valorile f2 ar trebui să fie apropiate de 100, iar valorile f2 mai mari de 50 (50-100) asigură similitudinea sau echivalența celor două curbe.
2.8. Analiza statistică
Rezultatele au fost analizate statistic pentru a testa diferențele semnificative prin testul t al lui Student, la un interval de încredere de 95%; valorile mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic.
3. Rezultate și discuții
Beletele de alginat și alginat-chitosan au fost obținute prin metoda de gelifiere ionotropă picurând o emulsie, compusă din soluție apoasă de alginat și faza autoemulsionantă de încărcare a medicamentului, prin ace de 23 G (600 μm) sau 27 G (400 μm), într-o baie de gelifiere de clorură de calciu sau într-o baie de gelifiere de clorură de calciu-chitosan. Excipienții selectați pentru faza autoemulsionantă au fost Labrasol, o componentă lichidă cu proprietăți de autoemulsionare și potențiator de solubilitate, și D-α-tocoferil polietilenglicol 1000 succinat ca agent coemulsionant și potențiator de absorbție (tabelul 1). Compoziția fazei autoemulsionante a fost aceeași utilizată într-o lucrare anterioară .
În figurile 1 și 2 sunt raportate imagini stereomicroscopice ale perlelor de alginat și alginat-chitosan umede și uscate. Imediat după prepararea bilelor CAl 600 [figura 1(a)] prezintă o formă regulată și dimensiuni omogene; acestea sunt albe și opace, cu o suprafață netedă, lucioasă și omogenă.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
.
(a)
(b)
(c)
(d)
Procesul de uscare nu schimbă forma mărgelelor, dar duce la reducerea dimensiunilor acestora și modifică caracteristicile suprafeței lor, care este neregulată și încrețită (figura 1(b)). Pierderea apei induce o diminuare a distanței dintre lanțurile polimerice și o variație a structurii mărgelelor, care nu este compactă și continuă, ci compusă din mici micronuclee care aderă unele la altele. Particulele CAlCh 600 complet umflate sunt ușor galbene, au o formă destul de regulată și prezintă o suprafață netedă [figura 1(c)]. În acest caz, procesul de uscare afectează forma sferică a bilelor [figura 1(d)]; acestea devin elipsoidale; dimensiunea lor scade, iar suprafața lor este foarte aspră. În plus, după uscare, se observă o aglomerare parțială a suprafeței bilelor: aceasta se datorează proprietăților adezive ale chitosanului . În cazul bilelor preparate cu ajutorul unui ac de 400 μm [figurile 2(a)-2(c)], imaginile înregistrate imediat după preparare demonstrează că, în cazul ambelor formulări (cu sau fără chitosan), particulele nu sunt omogene ca diametru, chiar dacă au o formă regulată. Bilele uscate CAl 400 și CAlCh 400 (figura 2(b)) au o suprafață caracterizată de asperitate și concavitate; în plus, în cazul formulării alginat-chitosan, forma particulelor este complet neregulată și este bine evidentă prezența unor punți solide de chitosan care leagă bilele împiedicând separarea lor.
Dimensiunea medie a bilelor încărcate cu celecoxib este cuprinsă între 715 și 896 μm (tabelul 2). Diametrul bilelor a fost semnificativ afectat de diametrul acului utilizat în timpul preparării (). Adăugarea chitosanului la bilele de alginat modifică semnificativ dimensiunile acestora doar atunci când a fost utilizat acul de 400 μm (). În plus, după cum indică valorile ridicate ale deviației standard, utilizând acul de 400 μm, produsul final este o familie de particule neomogene ca dimensiuni.
|
||||||||||||||||||||||||
Toate formulările conțin o cantitate mare de medicament (tabelul 2) distribuit omogen în matricea excipientului, iar diferențele dintre conținutul de medicament al acestora nu au fost semnificative, cu excepția CAlCh 400 ușor mai mic decât celelalte (). Procentul de celecoxib din bile depășește valoarea teoretică și acest lucru se datorează pierderii de Labrasol în timpul polimerizării , fapt justificabil având în vedere afinitatea mare dintre acest excipient și apă care îl împinge din bile în baia de gelificare.
O proprietate particulară a sistemelor microparticulare de alginat sau alginat-chitosan în formă uscată este capacitatea lor, după contactul cu un fluid apos, de a se rehidrata, de a prelua fluidul și de a suferi un proces de umflare, asociat în principal cu hidratarea grupărilor hidrofile ale polimerilor. În cazul în care fluidul este apa, aceasta pătrunde în particule umplând porii dintre lanțurile polimerice și provocând o umflare importantă a sistemului, fără eroziune/dezintegrare. Selectând fluide cu pH diferit, comportamentul de umflare al bilelor s-ar putea modifica. Din acest motiv, capacitatea de umflare a alginatului de calciu și a perlelor de alginat de calciu-chitosan a fost evaluată în HCl la pH 1,0 și în soluții tampon de fosfat la pH 6,8 și 7,4 (figurile 3-5).
În mediu acid (figura 3), nu există diferențe în ceea ce privește capacitatea de umflare a celor patru formulări; la acest pH, gradul maxim de umflare nu depășește 60%. Perlele de alginat și alginat-chitosan absorb o parte din lichid; greutatea lor crește inițial și apoi rămâne constantă. La acest pH, în cazul sistemelor de alginat (CAl 600 și CAl 400), grupările carboxilat ale polimerului localizate la suprafața particulelor sunt protonate și se formează un strat de acid alginic. Insolubilitatea acidului alginic în acest fluid și formarea de legături de hidrogen, responsabile de creșterea stabilității structurii, împiedică pătrunderea fluidului suplimentar în straturile mai profunde ale particulelor, limitând umflarea acestora. Același comportament de umflare este observat pentru sistemele CAlCh 600 și CAlCh 400. Chiar dacă, în mediu acid, chitosanul este foarte solubil și încărcat pentru transformarea unităților sale de amină în forma solubilă NH3+, interacțiunea dintre grupările amino și grupările carboxilice protonate nu este suficient de puternică pentru a favoriza umflarea. Astfel, comportamentul limitat de umflare totală este dominat de structura alginatului de calciu.
Figurile 4 și 5 arată că formulările prezintă o capacitate de umflare ridicată la pH 6,8 și pH 7,4. Pentru formularea CAl 600, greutatea particulelor crește rapid, atinge un vârf după 30 de minute și apoi scade brusc din cauza eroziunii/dezintegrării sistemului. Acest comportament se poate datora reacției de schimb de ioni între Na+ (prezent în tamponul fosfat) și Ca2+ legat de grupările carboxilice ale alginatului. Ionii monovalenți îi înlocuiesc pe cei bivalenți provocând ruperea structurii „egg-box” și creșterea distanței dintre lanțurile polimerice și favorizând absorbția fluidelor și umflarea sistemelor. Acest proces continuă până când presiunea osmotică din interiorul bilelor echilibrează rezistența legăturilor de reticulare și a încurcăturilor fizice, care păstrează structura bilelor. Astfel, particulele încep să se dezintegreze și greutatea lor scade.
Rezultatele obținute în urma studiului de umflare evidențiază faptul că mărgelele CAlCh 600 și CAlCh 400 sunt caracterizate de o structură mai rezistentă în comparație cu CAl 600 și CAl 400, probabil atribuibilă interacțiunilor dintre lanțurile de alginat și chitosan. Gradul maxim de umflare a perlelor de chitosan este mai mic decât cel al alginatului; sistemele alginat-chitosan sunt capabile să atingă un echilibru de umflare în aproximativ 30 de minute și să își mențină greutatea la un nivel constant până la sfârșitul testului. Probabil că interacțiunile dintre cei doi polimeri sunt responsabile de formarea unor particule cu o rezistență mecanică considerabilă, ceea ce limitează absorbția fluidului și dezintegrarea structurii. În cele din urmă, comparând comportamentul de umflare a bilelor de CAl 400 față de CAl 600 și CAlCh 400 față de CAlCh 600 (aceeași compoziție, diametru diferit al acului utilizat în procesul de preparare), se poate observa că în tampoanele de fosfat CAl 400 și CAlCh 400 au atins un vârf maxim de umflare mai mare decât cel al CAl 600 și, respectiv, CAlCh 600.
Profilele de eliberare a medicamentului obținute din diferitele formulări la pH-uri de 1,0, 6,8 și 7,4 sunt prezentate în figurile 6-8. Eliberarea in vitro a celecoxibului este afectată de pH-ul fluidului selectat: procentul de medicament eliberat în mediu acid în două ore este destul de scăzut și variază între 12,70% și 24,53% (figura 6). Întârzierea eliberării celecoxibului poate fi atribuită capacității reduse de umflare a sistemelor în acest fluid; nici compoziția bilelor, nici diametrul acestora nu afectează performanța de eliberare a medicamentului (valorile parametrilor f2 întotdeauna peste 50). La pH 1,0, procesul de eliberare este guvernat doar de difuzia medicamentului. Acest rezultat permite satisfacerea primului obiect al acestei lucrări de cercetare care este acela de a minimiza eliberarea medicamentului în mediu acid pentru a promova și favoriza acest proces la nivel intestinal.
În tamponul de fosfat la pH 6,8, formulările sunt caracterizate de un comportament de eliberare a medicamentului afectat de compoziția lor și nu semnificativ de dimensiunile acestora (Figura 7). În acest fluid, sistemele se umflă inițial și apoi se erodează/se dezintegrează și, în consecință, procesul de eliberare a medicamentului este condus la început de difuzie și apoi de relaxarea polimerică. Perlele de alginat (CAl 600 și CAl 400) sunt capabile să finalizeze eliberarea celecoxibului în aproximativ opt ore; dimpotrivă, nu mai mult de 75 % din medicamentul încărcat în perlele de alginat-chitosan trece în soluție după același timp. Comparația rezultatelor obținute cu formulările de microparticule de alginat și alginat-chitosan relevă faptul că profilurile nu sunt similare, având valori f2 mai mici de 50. O posibilă explicație pentru un astfel de comportament este interacțiunea electrostatică dintre grupele carboxil ale alginatului și grupa amino a chitosanului care îmbunătățește rezistența mecanică a rețelei polimerice reducând umflarea și eroziunea acesteia la pH 6,8.
În mod surprinzător, viteza de eliberare a celecoxibului încetinește în principal pentru formularea CAlCh 400 chiar dacă această formulare este caracterizată de cea mai mică dimensiune a particulelor. Probabil că diametrul mic și suprafața mare a acestor particule duc la formarea unui strat mai gros de chitosan în jurul bilelor, care opune o mare rezistență la absorbția fluidului și, în consecință, la eliberarea medicamentului.
De asemenea, la pH 7,4, diferențele dintre performanțele de eliberare a medicamentului pot fi atribuite mai degrabă compoziției formulării decât dimensiunilor particulelor (figura 8). Toate formulările au prezentat o rată de eliberare a medicamentului aproape constantă. Nu există diferențe între curbele de eliberare CAl 600 și CAl 400 și între curbele de eliberare CAlCh 600 și CAlCh 400; atunci când chitosanul se află în mărgele, rata de eliberare a medicamentului scade.
Aceleași concluzii sunt evidențiate și de analiza rezultatelor eliberării medicamentului prin intermediul parametrilor de dizolvare (t10%, t50% și t90%) (tabelul 3). Diferențele în comportamentul de eliberare a bilelor sunt detectate, de asemenea, prin intermediul parametrilor de dizolvare t10%, t50% și t90% și sunt bine evidențiate pentru timpul necesar pentru eliberarea a 50 și 90% din medicamentul încărcat. În soluțiile tampon de fosfat, perlele de alginat-chitosan necesită timpi mai lungi pentru a elibera 50 și 90% din celecoxib în comparație cu perlele de alginat. Probabil că prezența complexului alginat-chitosan provoacă o creștere a ridurilor structurale, neregularitatea și complexitatea structurii perlelor, care îngreunează eliberarea medicamentului.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Leave a Reply