Originea forței electroforetice asupra ADN-ului în nanopori în stare solidă

Transportul de macromolecule prin nanopori biologici6,7 și artificiali8,9,9,10,11,12, determinat de tensiune, oferă un sistem ideal pentru studierea fizicii procesului de translocare13. Migrația electroforetică este principala forță motrice pentru translocarea ADN-ului prin nanopori și este o consecință a forței exercitate de un câmp electric aplicat din exterior asupra sarcinilor de pe lanțul de polielectroliți. Deoarece ADN-ul în soluție este încărcat negativ, acesta este ecranat de un strat de contraioni mai mult sau mai puțin mobili, încărcați pozitiv, care, de asemenea, sunt supuși câmpului electric. De mult timp este recunoscut faptul că forța exercitată asupra contraionilor induce o forță de rezistență hidrodinamică asupra ADN-ului care echilibrează local forța electrică, ceea ce duce la o migrare mult mai lentă decât ar fi de așteptat doar din cauza rezistenței Stokes (a se vedea, de exemplu, ref. 1). Translocația electroforetică a unui polimer printr-un por mic ascultă de principii similare, dar aici se așteaptă ca geometria porului (sau structura locală a gelului) să influențeze profund profilul fluxului hidrodinamic în jurul ADN-ului și, prin urmare, forța de rezistență care se opune mișcării1,5,14. În ciuda experimentelor din ce în ce mai sofisticate3,12,15,16, nu a fost încă raportată o manifestare neechivocă a interacțiunilor hidrodinamice în translocarea ADN-ului. Aici, abordăm această problemă folosind aparatul nostru recent dezvoltat care combină nanopori în stare solidă cu pensete optice3 pentru a opri translocarea ADN-ului și, ulterior, pentru a măsura forța de blocaj pe un singur fir de ADN (a se vedea secțiunea Metode). O diagramă schematică a aparatului de măsurare este prezentată în Fig. 1a.

a, Diagramă schematică a aparatului de măsurare. Folosind pensete optice, translocația ADN-ului este blocată și se măsoară forța asupra ADN-ului. Conductanța ionică a nanoporului este, de asemenea, măsurată simultan. b, Model cilindric de ADN într-un nanopor. Săgețile albastre de o parte și de alta a ADN-ului descriu schematic viteza fluidului în mișcare datorată electro-osmozei.

În contrast cu un experiment de electroforeză pe gel, câmpul electric într-un experiment cu nanopori este limitat la imediata vecinătate a porului și forțele electrice acționează local asupra unui segment scurt de ADN. Intensitatea câmpului electric în por ajunge de obicei la ∼106 V m-1 datorită membranelor foarte subțiri (∼60 nm) care stau pe loc. Lungimea mare de persistență a λ-ADN, de aproximativ 50 nm, asigură faptul că segmentul de ADN din interiorul porului este practic complet extins. Situația este reprezentată schematic în Fig. 1b, unde L și R reprezintă lungimea și raza porului, iar ΔV este potențialul aplicat. ADN-ul are o densitate de sarcină de linie goală λbare=-0,96 nC m-1 (2 electroni pe pereche de baze) și este modelat aici ca un cilindru încărcat uniform cu raza a=1,1 nm. Forța electrostatică goală pe coloana vertebrală a ADN este reprezentată de Fbare=λbareΔV (ref. 3). Acestei forțe i se opune o forță de rezistență Fdrag cauzată de mișcarea electroforetică a contraionilor săi în direcția opusă: Fdrag este astfel o componentă intrinsecă a procesului de translocație care, în ultimă instanță, poate fi pusă, de asemenea, în legătură cu forțele electrice5. Forța netă rezultată este forța electroforetică care conduce translocația, dată de Felec=Fbare-Fdrag. În cazul nostru, Felec este echilibrată de o forță mecanică opusă Fmech=-Felec de la penseta optică care oprește ADN-ul în interiorul porului.

Originea lui Fdrag se află în distribuția spațială a ionilor și în profilul corespunzător al fluxului de fluid. O descriere în câmp mediu a distribuției ionilor este dată de formalismul Poisson-Boltzmann, în care potențialul electrostatic este dat de , iar distribuțiile ionice corespunzătoare de . Aici, λD este lungimea Debye, este potențialul electrostatic redus, e este sarcina elementară, Φ este potențialul, kB este constanta Boltzmann, T este temperatura, n este densitatea numerică a ionilor și z este valența speciei ionice. Figura 2a prezintă potențialele calculate pentru două dimensiuni de pori obținute prin evaluarea numerică a ecuației Poisson-Boltzmann într-o geometrie cilindrică (a se vedea secțiunea Metode). Distribuțiile ionice corespunzătoare sunt prezentate în Fig. 2b. Stratul Debye al ADN-ului este caracterizat de o epuizare a coionilor, în timp ce contraionii se acumulează până la densități foarte mari din cauza sarcinii ridicate a ADN-ului. Deoarece aceste distribuții sunt soluții ale ecuației Poisson-Boltzmann complete (neliniarizate), este inclus efectul condensării Manning17.

a, Potențial electrostatic redus pentru un por „mare” (verde, R=10 nm) și un por „mic” (albastru, R=3 nm). Linia gri indică localizarea peretelui porului pentru porul mic. Concentrația de sare este cbulk=20 mM (λD=2,2 nm), iar pereții porilor sunt considerați ca fiind lipsiți de sarcină în acest calcul special pentru simplificare. b, Distribuțiile ionice corespunzătoare. În porii „mari” (R≫λD), distribuția ionilor în jurul ADN-ului nu este afectată în mod semnificativ de peretele porului, după cum indică observația conform căreia curbele verzi ating valoarea globală. Cu toate acestea, în porii „mici” (R≲λD), norul de contraioni (curbe solide) este comprimat de peretele porului și porul poate fi sărăcit de coioni (curbe punctate), lăsând în principal contraioni pozitivi pentru a echilibra sarcinile negative de pe ADN. Această situație este exemplificată de curbele albastre. c, Profiluri de viteză a fluidului calculate prin combinarea rezultatelor de la a și b cu ecuația Stokes. d, Integrala de suprafață normalizată a tensiunii de forfecare la fiecare poziție r, calculată ca , τ fiind tensiunea de forfecare în fluid. La suprafața ADN, . e, Potențiali de suprafață reduși calculați pentru ADN (roșu) și peretele nanoporului (gri) în funcție de raza porilor. Zona gri descrie calitativ regiunea „porilor mici”, în care distribuția ionilor este influențată de confinarea nanoporului.

În experimentul nostru de stagnare a ADN-ului, distribuția contraionilor determină în mare măsură profilul vitezei fluxului electro-osmotic indus. Profilul vitezei de curgere poate fi calculat prin rezolvarea ecuației lui Stokes , unde η este vâscozitatea dinamică a fluidului, vz este viteza fluidului, Ez este câmpul electric aplicat și ρ(r) este distribuția sarcinii ionice. Profilele de curgere a fluidului calculate sunt prezentate în Fig. 2c. Ulterior, pentru a corela profilul de curgere cu rezistența vâscoasă, se calculează tensiunea de forfecare în fluid ca τ(r)=-η(dvz/dr). Figura 2d arată , care este egal cu raportul Fdrag/Fbare atunci când este evaluat la suprafața ADN (r=a). Aceasta arată că Fdrag este de același ordin de mărime ca și forța electrostatică goală care acționează asupra ADN-ului căruia i se opune. Fdrag este mai mare pentru porul mai mare, ceea ce corespunde unei forțe de blocaj mai mici.

Pentru comparație cu experimentele noastre, este convenabil să exprimăm modelul de mai sus într-o formă care relaționează direct forța electroforetică cu proprietățile nanoporului. Așa cum s-a arătat anterior5, ecuațiile Poisson-Boltzmann și Stokes pot fi combinate pentru a obține o expresie pentru forța electroforetică asupra unei molecule staționare,

Φ(a) și Φ(R) sunt potențialele de suprafață ale ADN-ului și, respectiv, ale nanoporului, iar ε este constanta dielectrică a apei. și deduse din ecuația Poisson-Boltzmann sunt reprezentate grafic în Fig. 2e în funcție de R. În porii mari, potențialele de suprafață sunt independente de R. Ecuația (1) prezice atunci că forța măsurată Fmech are o dependență simplă ln-1(R/a) de dimensiunea porului. În porii mai mici, pe de altă parte, stratul Debye este comprimat de peretele porului (Fig. 2). Acest lucru are ca rezultat o dependență a potențialelor de suprafață de dimensiunea porilor și o dependență corespunzător mai complicată a lui Fmech de R.

O modalitate de a testa direct modelul de mai sus este de a măsura forța de blocaj a ADN-ului Fmech în funcție de raza porului R. Deoarece lucrările anterioare s-au concentrat pe pori mai mici, totuși, noi demonstrăm mai întâi că este posibil să detectăm prezența unei singure molecule de ADN în nanopori foarte mari (R≫a). Detectarea ADN-ului în por se bazează pe măsurarea pasului în conductanța ionică ΔG atunci când ADN-ul intră în por. S-a demonstrat anterior că ΔG este cauzată de competiția dintre două contribuții: excluderea de volum, care scade numărul de ioni disponibili pentru conductanță, și un exces de contraioni de ADN, care crește efectiv numărul de ioni disponibili pentru conductanță12. Care dintre aceste două efecte predomină depinde de concentrația totală a electrolitului, ceea ce face ca ΔG să fie pozitiv (creșterea conductibilității) în experimentele prezente cu 20-50 mM de sare. În aceste condiții optimizate de sare, se preconizează că raportul semnal/zgomot al captării ADN-ului va fi ridicat chiar și în porii foarte mari18. O treaptă tipică a curentului împreună cu modificarea corespunzătoare a poziției Z a bilei este prezentată în Fig. 3a. Observăm o treaptă clară a curentului, chiar dacă ADN-ul modifică conductanța nanoporului cu mai puțin de 1 %. O histogramă tipică a evenimentelor de captură este prezentată în Fig. 3b. Aceste date arată că suntem capabili să inserăm și să detectăm în mod controlabil molecule unice chiar și în nanopori cu R=45 nm, unde ADN-ul acoperă doar 1/2000 din suprafața secțiunii transversale a nanoporului.

a, Exemplu tipic de curent de por I (panoul superior, cu medie roșie) și poziția bilei Z (panoul inferior) în timpul capturării ADN-ului într-un por R=39 nm într-un por R=39 nm în 33 mM KCl la 80 mV. Măsurătorile de curent au fost filtrate cu trecere joasă la 1 kHz. b, Histograma ΔG a 88 de capturi de ADN în nanopor în aceleași condiții ca în a. c, ΔG în pori de diferite raze. Evenimentele de captare au avut loc de obicei la tensiuni de 60-100 mV. Linia punctată orizontală este un ghid pentru ochi. Triunghiuri: 20 mM KCl, stele: 33 mM KCl, romburi: 50 mM KCl, stea verde: date de la b, bare de eroare: abaterea standard evaluată din histogramele ΔG. Simbolurile deschise reprezintă date din experimente de translocare liberă fără pensete optice.

Valorile ΔG determinate experimental în funcție de raza nanoporului sunt prezentate în Fig. 3c pentru 10 nanopori cu raze cuprinse între R=3 și 45 nm. Zona gri indică regiunea „porilor mici” în care, conform calculelor din Fig. 2b, distribuția ionilor în apropierea ADN-ului este influențată de prezența peretelui nanoporului. În aparentă concordanță cu simulările, ΔG este aproximativ constantă în nanoporii mari. ΔG mai mare în nanoporii mici este în concordanță cu comprimarea stratului de ecranare difuză, asigurând neutralitatea sarcinii în por. Cu toate acestea, o comparație mai cantitativă a ΔG măsurate cu teoria este dificilă: rezistența de acces Racc devine o contribuție din ce în ce mai importantă la rezistența totală a sistemului în porii mari19 , iar în prezent nu se știe cum afectează Racc prezența ADN-ului care se înfășoară prin por.

După ce am stabilit fezabilitatea opririi și detectării moleculelor de ADN atât în pori mari, cât și în pori mici, trecem acum la principalul rezultat al acestei scrisori, și anume, magnitudinea determinată experimental a forței de oprire Fmech în funcție de raza nanoporului R. Figura 4a prezintă Fmech în funcție de tensiunea aplicată ΔV în nanopori cu R=4 nm (panoul din stânga) și R=39 nm (panoul din dreapta). Această relație este aproximativ liniară în ambele cazuri. Cu toate acestea, Fmech/ΔV în porul mic este de un factor de două ori mai mare decât în porul mare. Figura 4b prezintă raportul Fmech/ΔV în funcție de dimensiunea porilor: Fmech/ΔV scade treptat odată cu creșterea dimensiunii, așa cum era de așteptat pe baza ecuației (1). Curba punctată rezultă din combinarea potențialelor de suprafață pentru întreaga încărcătură de ADN (Fig. 2e) cu ecuația (1), fără ajustări suplimentare. În ciuda simplificărilor inerente ale unui model unidimensional, rezultatul teoretic surprinde destul de bine tendința din date, deși supraestimează cantitativ forța de staționare cu ∼50%. Această diferență poate fi atribuită (unei combinații de) mai mulți factori, inclusiv o reducere a mobilității contraionilor la suprafața ADN-ului12,20, sau un flux de fluid electro-osmotic opus suplimentar care rezultă din sarcinile fixe de pe suprafața nanoporului5. În termenii ecuației (1), ambele efecte pot fi reprezentate prin scăderea magnitudinii diferenței de potențial de suprafață ΔΦ=Φ(a)-Φ(R), reducând astfel magnitudinea lui Fmech. Reducerea empirică a lui ΔΦ cu 33% are ca rezultat curba solidă din Fig. 4b, o potrivire excelentă cu datele experimentale. Această reducere a ΔΦ este echivalentă cu aproximativ 50 % din sarcina goală a ADN-ului fiind ecranată de ioni care sunt efectiv imobilizați pe suprafața sa (așa cum se arată în figura suplimentară S1) sau cu prezența unei sarcini de suprafață de 15 mC m-2 pe peretele porilor (figura suplimentară S2). Deși experimentul nostru nu poate face o distincție directă între aceste două mecanisme, densitatea de sarcină de suprafață dedusă este tipică pentru suprafețele SiO221. Acest lucru sugerează că densitatea de sarcină de suprafață din nanoporii noștri nu este puternic influențată de procesul de fabricare și că sarcina din pori este responsabilă pentru o parte substanțială a corecției observate.

a, Măsurători ale forței de blocaj în funcție de potențialul aplicat într-un nanopor mic (panoul din stânga) și într-un nanopor mare (panoul din dreapta). În fiecare caz, sunt prezentate două măsurători obținute la distanțe diferite între perlă și nanopor. b, Forța măsurată în funcție de raza porului. Simbolurile albastre și verzi corespund datelor din a. Datele din zona porilor mici au fost preluate din ref. 3. Curbele reprezintă rezultatul teoretic pentru sarcina ADN goală (curbă punctată) și pentru un ΔΦ redus (linie continuă, a se vedea textul). Inserția arată schematic modul în care forța asupra contraionilor ADN este împărțită între ADN și pereții porilor prin rezistență vâscoasă într-un por mic și într-un por mare; săgeata galbenă reprezintă forța electrostatică goală care acționează asupra ADN. Triunghiuri: 20 mM KCl, stele: 33 mM KCl, romburi: 50 mM KCl. Barele de eroare provin din incertitudinile în calibrarea capcanei optice, care sunt estimate la 10-30% din rigiditatea calibrată a capcanei.

Factori externi care nu sunt luați în considerare în modelul nostru simplu ar putea afecta, de asemenea, valoarea absolută a forței de blocaj. De exemplu, ar putea fi polarizată de forțele electrostatice și/sau hidrodinamice de pe perlă sau de pe porțiunea de ADN care se află în câmpul electric chiar în afara nanoporului. Cu toate acestea, experimentele noastre nu arată nicio dovadă a unor astfel de efecte, deoarece nu am detectat nicio modificare a forței de blocaj atunci când bila a fost poziționată la distanțe din ce în ce mai mari față de nanopor3. În plus, curbele experimentale forță-tensiune sunt liniare în intervalul nostru de tensiune (Fig. 4a), ceea ce indică faptul că forțele entropice sunt mici în comparație cu forțele electrostatice, în concordanță cu măsurătorile independente ale forțelor entropice în întinderea ADN22.

Dependența forței măsurate de raza porului din Fig. 4b demonstrează în mod direct că forța electroforetică în translocarea ADN-ului este în parte determinată de cuplajul hidrodinamic dintre contraionii ADN-ului și peretele nanoporului. Geometria nanoporului determină amploarea forței de rezistență exercitate asupra ADN-ului de către acești contraioni. Acest cuplaj are consecințe importante pentru interpretarea forțelor determinate experimental, deoarece aceste forțe nu sunt în mod evident determinate doar de proprietățile intrinseci ale ADN-ului1,23.

Variații ale forței pot fi, de asemenea, așteptate odată cu creșterea concentrației de sare, deoarece aceasta modifică lungimea Debye și, prin urmare, atât potențialul de suprafață al ADN-ului, cât și, probabil, forța de blocaj Fmech. Această așteptare este însă complicată de faptul că densitatea de sarcină de suprafață a porilor se modifică, de asemenea, în mod considerabil odată cu concentrația de sare12 și că teoria câmpului mediu utilizată aici devine nesigură la o forță ionică ridicată. În experimentele anterioare, s-a constatat, de fapt, că Fmech este independentă de concentrația de sare până la 1 M (ref. 3), iar o interpretare a acestor date bazată pe un model în care Φ(R) depinde de concentrația de sare a fost sugerată de Ghosal5.

În translocația liberă a ADN-ului, forța de restabilire Fmech este absentă și este efectiv înlocuită de o rezistență Stokes suplimentară FStokes proporțională cu viteza moleculei. Molecula se translocă la viteză constantă, forța electroforetică fiind echilibrată de FStokes. Relația dintre forța de blocaj Fmech, măsurată cu penseta optică, și viteza de translocare vtrans, determinată din experimentele de translocare a ADN-ului liber, este dată de4,5,14

Acest rezultat este echivalent cu rezistența Stokes pe care ar trebui să o resimtă un cilindru neîncărcat care se translocă printr-un por cilindric cu viteza constantă vtrans. Astfel, Fmech și vtrans sunt mărimi proporționale, legate printr-un factor care depinde de geometrie. Această așteptare este confirmată calitativ de datele experimentale3,12, care arată că Fmech și vtrans sunt într-adevăr aproximativ proporționale. Calculând vtrans ca lungime a conturului λ-ADN împărțită la timpul de translocare determinat experimental se obține vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, rezultând Fmech/vtrans=1,750 pN s m-1 (date pentru pori cu raza de 5 nm). Cu toate acestea, ecuația (2) dă o valoare de 249 pN s m-1 pentru acest factor, folosind η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm și a=1,1 nm. Aceasta este de șapte ori mai mică decât valoarea obținută experimental. Prin urmare, translocarea ADN-ului prin acești pori are loc la o viteză mult mai mică decât cea așteptată din forțele electroforetice măsurate cu ajutorul pensetelor optice și din descrierea câmpului mediu. Având în vedere că în toate aceste experimente au fost utilizați nanopori similari, această concluzie indică o diferență mai fundamentală între situația statică a unei molecule în staționare și situația dinamică a unei molecule în translocare. În cazul translocației libere a ADN-ului, conformația ADN-ului în afara porului are ca rezultat o rezistență suplimentară asupra moleculei în mișcare24, ceea ce poate explica discrepanța.

În concluzie, am arătat că forța electroforetică asupra unei molecule de ADN într-un nanopor depinde de geometria porului. Acest lucru nu este așteptat din electrostatica simplă, dar poate fi înțeles în mod direct prin luarea în considerare a rezistenței hidrodinamice induse de contraionii care ecranează ADN-ul în soluție. Calculele numerice bazate pe ecuațiile câmpului mediu oferă o bună descriere a dependenței dimensiunii porilor de forțele măsurate.

.