Neutrophil Diapedesis: Paracelulară sau transcelulară?

Una dintre caracteristicile clasice ale inflamației este infiltrarea țesutului afectat de către leucocite polimorfonucleare (PMN). Pentru ca acest lucru să aibă loc, PMN aflate în circulație trebuie să sufere interacțiuni adezive cu endoteliul care să le permită să se activeze, să se aplatizeze și să emigreze prin mucoasa endotelială a microvaselor. Determinanții moleculari ai acestor interacțiuni adezive au fost studiați pe larg și există un consens general în ceea ce privește secvența de evenimente care duce la plasarea PMN în poziția de a emigra în țesuturi (3, 12). Inițial, are loc o interacțiune adezivă slabă între PMN care circulă și endoteliu, care are ca rezultat mișcarea saltatorie a PMN de-a lungul endoteliului, un fenomen denumit rostogolire. Rularea permite PMN să rămână în apoziție strânsă pe endoteliu și, în cazul în care sunt prezenți mediatori inflamatori generați la nivel local, PMN se activează. Odată activate, PMN formează interacțiuni adezive mai puternice cu endoteliul, ceea ce duce la oprirea lor. Ulterior, PMN emigrează peste endoteliu. Spre deosebire de cazul interacțiunilor adezive inițiale (rostogolire și adeziune), despre care există un consens general cu privire la mecanismele implicate, se cunosc puține lucruri în ceea ce privește mecanismele implicate în migrația transendotelială a PMN. Chiar și premisa de bază dacă PMN emigrează între celulele endoteliale (cale paracelulară) sau prin celulele endoteliale propriu-zise (cale transcelulară) este controversată.

Consensul predominant susține că PMN circulante emigrează din compartimentul intravascular în interstițiu prin trecerea între celulele endoteliale adiacente, adică folosind o cale paracelulară (11). Atât studiile in vivo, cât și cele in vitro, care utilizează microscopia electronică și luminoasă, au surprins PMN migranți care își extind pseudopodiile între celulele endoteliale pentru a trece prin bariera endotelială ca răspuns la un gradient chemotactic. Pentru ca PMN să poată utiliza calea paracelulară pentru migrația transendotelială, cuplarea adezivă dintre celulele endoteliale adiacente trebuie să fie întreruptă, iar celulele endoteliale trebuie să se separe una de cealaltă suficient de mult pentru a permite trecerea PMN. Mulți mediatori inflamatori utilizați pentru a simula inflamația in vitro pot, în sine, să inducă formarea de goluri în monostraturile de celule endoteliale cultivate, adică retracția celulelor endoteliale. Cu toate acestea, deoarece spațiile mari între celulele endoteliale sunt rareori observate în modelele in vivo de inflamație, acest fenomen poate reprezenta un efect exagerat al mediatorilor inflamatori în sistemele in vitro. Monostraturile endoteliale cultivate au joncțiunile de adeziune interendoteliale subdezvoltate în comparație cu omologii lor in vivo și, astfel, mediatorii inflamatori pot produce mai ușor retracția celulelor endoteliale in vitro decât in vivo (12). Corelația in vivo a acestui fenomen este creșterea scurgerii macromoleculare prin joncțiunile interendoteliale observată ca răspuns la mediatorii inflamatori. Împreună, studiile in vitro acreditează ideea că celulele endoteliale se pot separa unele de altele ca răspuns la mediatorii inflamatori, deși amploarea separării poate fi exagerată.

Dovezile că PMN pot induce retracția celulelor endoteliale provin în principal din studii in vitro care au abordat mecanismele implicate în leziunea celulelor endoteliale mediată de PMN (12). Această leziune a fost de natură nelitice și s-a manifestat prin desprinderea celulelor endoteliale din monostraturile cultivate pe suprafețe neporoase. Această desprindere a celulelor endoteliale a avut loc la 3-6 ore după așezarea PMN activate pe suprafața monostraturilor de celule endoteliale și a fost atribuită elastazei derivate din PMN. Deoarece celulele endoteliale detașate sunt rareori observate în modelele in vivo de inflamație, detașarea celulelor endoteliale mediată de PMN pare a fi, de asemenea, o exagerare a unui eveniment in vivo din cauza condițiilor experimentale impuse in vitro. În aceste sisteme (monostraturi endoteliale cultivate pe suprafețe neporoase), PMN nu li se permite PMN să transmigreze și să se îndepărteze de monostraturile de celule endoteliale. Astfel, aceștia rămân în imediata apropiere a celulelor endoteliale și persistă în agravarea proteolitică a monostratului, inducând în cele din urmă retracția celulelor endoteliale și detașarea ulterioară. Dacă PMN activate sunt lăsate să migreze prin monostraturile de celule endoteliale, se observă rareori retracția și detașarea grosieră a celulelor endoteliale.

Elastaza derivată din PMN poate induce retracția și detașarea celulelor endoteliale în cadrul monostraturilor. Acest lucru este analog cu utilizarea proteazelor pentru a extinde celulele endoteliale, adică celulele tratate cu protează se retrag și se detașează de substrat, dar după tratamentul cu inhibitori de protează, acestea pot fi reînsămânțate și continuă să crească normal. Este interesant faptul că atât retragerea celulelor endoteliale, cât și migrarea transendotelială a PMN pot fi împiedicate de inhibitorii de protează (de exemplu, de elastază). Aceste ultime observații indică faptul că PMN folosesc elastaza endogenă pentru a induce retracția celulelor endoteliale de o amploare suficientă pentru a le permite să treacă între celulele endoteliale adiacente fără a le afecta. Studii recente sugerează că migrația transendotelială a PMN mediată de elastază este un proces foarte bine reglementat care nu necesită degranularea PMN (3). PMN activate nu secretă elastază în mediul extracelular; mai degrabă, ele mobilizează elastaza pe membrană și o localizează pe frontul de migrație, de exemplu, pseudopodiile care pătrund între celulele endoteliale adiacente. Faptul că degranularea PMN nu este necesară pentru migrarea transendotelială a acestora este susținut în continuare de observația că citoplastele PMN (PMN anucleare lipsite de granule) migrează prin monostraturile endoteliale ca răspuns la un gradient chemotactic la fel de eficient ca PMN normale. Din nou, migrarea transendotelială a citoplastelor poate fi împiedicată de inhibitorii de elastază.

Celele endoteliale sunt ținute împreună de joncțiuni de adeziune compuse din proteine transmembranare (11). Astfel, pentru ca neutrofilele să treacă între celulele endoteliale, interacțiunile adezive ale acestor joncțiuni trebuie să fie întrerupte. Există două joncțiuni de adeziune relevante pentru migrația transendotelială a PMN: joncțiunile adherens și joncțiunile strânse. Joncțiunile aderențiale constau în complexe vasculo-endoteliale (VE)-cadherină/catenină. VE-cadherina are un domeniu extracelular care interacționează homotipic cu VE-cadherina de pe celulele endoteliale adiacente. Domeniul citoplasmatic al VE-cadherinei se asociază cu β- sau γ-cateninele intracelulare. Aceste complexe VE-cadherină/catenină sunt conectate la citoscheletul de actină prin intermediul α-cateninei (Fig. 1A). Joncțiunile strânse constau din mai multe proteine transmembranare, inclusiv occludina și claudinele 1 și 2, și proteine intracelulare asociate, cum ar fi ZO-1, -2 și -3, care leagă proteinele de joncțiune strânsă de citoschelet. Dintre aceste două joncțiuni de adeziune, efectul migrației transendoteliale a PMN asupra joncțiunilor adherens a primit cea mai mare atenție.

FIGURA 1. Reprezentarea schematică a posibilelor mecanisme care mediază diapedeza paracelulară in vitro (A) și diapedeza transcelulară in vivo (B). A: Diadeza PMN prin joncțiunile celulă-celulă endotelială implică dezasamblarea complexelor cadherină/catenină endoteliale (bare albastre). Acest lucru poate avea loc fie pe cale proteolitică prin intermediul elastazei de suprafață (cercuri roșii), fie prin activarea semnalizării intracelulare mediate de aderență. B: PMN aderent inserează procese de tip filopode în formarea caveolelor endoteliale sau a organitelor veziculo-vacuolare (1), obținând astfel acces la partea abluminală (2). Procesele endoteliale înghit porțiunea luminală a PMN (3) și resigilează vasul înainte ca PMN să migreze în țesut (4). Săgețile, joncțiunile intercelulare endoteliale.

Studii recente cu ajutorul microscopiei confocale indică faptul că interacțiunile adezive ale PMN (aderența și migrația transendotelială) pot duce la întreruperea locală a proteinelor de joncțiune adherens (10). Au fost capturate două populații de PMN care aderă la monostraturile de celule endoteliale: 1) cele sub care nu a existat nicio întrerupere a continuității proteinelor de joncțiune aderenă și 2) cele sub care a existat o întrerupere a proteinelor de joncțiune aderenă. Întreruperea continuității joncțiunii aderente de către PMN aderente a fost un fenomen local, deoarece joncțiunile aderente mai îndepărtate de PMN nu au fost afectate. O analiză sistematică a arătat că proteinele de joncțiune aderentă de sub PMN aderente au fost afectate în mod secvențial, adică β-catenina a fost pierdută înainte de VE-cadherina. PMN capturați în procesul de migrare transendotelială au fost invariabil asociați cu pierderea tuturor proteinelor de joncțiune aderentă la locul de migrare. Din nou, nu a existat niciun efect asupra integrității joncțiunii aderente în locurile mai îndepărtate de PMN care au migrat. În plus, dovezile privind importanța întreruperii joncțiunii adherens în migrația transendotelială a PMN includ următoarele: 1) in vivo, anticorpii împotriva VE-cadherinei au crescut emigrarea PMN și 2) in vitro, anticorpii împotriva VE-cadherinei au crescut migrația transendotelială a PMN și au indus reorganizarea citoscheletului endotelial de actină, ducând la formarea de goluri între celulele endoteliale.

În ceea ce privește complexele de joncțiune strânsă, studii recente au făcut observații similare. Migrația transendotelială a PMN a întrerupt continuitatea ZO-1 și -2 numai la locul de pătrundere a PMN în joncțiunile interendoteliale (1). Nu au fost observate discontinuități generalizate în joncțiunile strânse.

Mecanisme potențiale implicate în diapedeza paracelulară

Mecanismul prin care interacțiunile adezive PMN-celule endoteliale perturbă joncțiunea adherens nu este clar. O posibilitate este că PMN aderente folosesc proteaze endogene pentru a degrada proteinele joncțiunii aderente (Fig. 1A). De exemplu, inhibitorii de elastază au fost capabili să diminueze gradul de pierdere indusă de PMN a proteinelor joncțiunii aderente VE-cadherină și β-catenină (2). Alte studii (11) indică faptul că PMN activate pot degrada VE-cadherina și că un inhibitor de elastază poate preveni această degradare. Mai mult, elastaza neutrofilă purificată produce produse de degradare a VE-cadherinei similare cu cele observate după degradarea acestei componente a joncțiunii aderente de către PMN activate. Împreună, pare probabil ca elastaza derivată de PMN să joace un rol în întreruperea joncțiunii adherens.

Interacțiunile adezive PMN-celule endoteliale ar putea, de asemenea, să semnaleze celulelor endoteliale să participe activ la migrația transendotelială a PMN prin separarea una de cealaltă, adică formarea de lacune interendoteliale (Fig. 1A). Această afirmație este susținută de următoarele linii de dovezi. PMN aderenți pot induce creșteri ale nivelurilor de Ca2+ în celulele endoteliale, iar chelarea acestui Ca2+ duce la inhibarea migrației transendoteliale a PMN. Mai mult decât atât, inhibarea miozinei endoteliale cu lanț ușor kinaza (un factor determinant cheie al formării spațiului dintre celulele endoteliale) a redus migrația transendotelială a PMN (11). În cele din urmă, după cum s-a subliniat mai sus, PMN aderente afectează β-catenina intracelulară înainte de VE-cadherina care se întinde pe membrana plasmatică. Împreună, aceste observații indică faptul că celulele endoteliale pot fi induse să participe în mod activ la migrația transendotelială a PMN prin retragerea una față de cealaltă.

Evidențe în favoarea diapedezei transcelulare

Multe rapoarte timpurii și mai recente care au examinat diapedeza leucocitelor in vivo folosind o abordare ultrastructurală indică faptul că majoritatea PMN-urilor ies din vasculatură pe cale transcelulară, adică, prin pori sau pasaje care traversează citoplasma endotelială. Examinarea secțiunilor în serie cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie sugerează că PMN-urile pot migra prin regiuni care nu sunt asociate cu joncțiuni celulă-celulă identificabile (4, 5, 8). S-a argumentat că nici măcar secțiunile în serie nu dovedesc fără echivoc faptul că o joncțiune celulă-celulă nu se afla în apropiere, ci mai degrabă că este posibil ca aceasta să fi fost ratată. În plus, poate fi dificil să se identifice joncțiunile adherens cu densitate electronică, în special în acele regiuni în care endoteliul are o înălțime de <0,5 μm. În cele din urmă, date recente in vitro indică faptul că joncțiunile aderente celulă-celulă se dezasamblează molecular în timpul diapedezei PMN (10) și, prin urmare, nu ne-am aștepta să le vedem morfologic.

Imaginile de microscopie electronică cu scanare oferă dovezi mai convingătoare că PMN pătrund în celulele endoteliale prin deschideri care nu sunt asociate cu contacte celulă-celulă endotelială (4, 9). PMN care se află în procesul de diapedză par să aibă o formă de halteră, cu o constricție în regiunea de la nivelul endoteliului (4, 5, 7, 8, 8, 9, 13, 15). În funcție de cât de mult a progresat diapedeza, se observă o extensie în formă de bulă care fie iese în lumenul vasului, fie se extinde în interstițiu (5, 9, 11, 15). Acest lucru indică faptul că leucocitele se strecoară printr-un por circular cu un diametru mic, limitat, mai degrabă decât să inducă retragerea celulelor endoteliale individuale unele de altele. Celula endotelială și leucocitele rămân în contact strâns pe tot parcursul diapedzei. Endoteliul pare adesea să se întindă de-a lungul părții luminale a suprafeței PMN pentru a-l înghiți complet, închizând astfel spațiul luminal înainte ca PMN să fie eliberat în matricea tisulară (4, 5, 8). Acest proces a fost observat frecvent în timpul emigrării in vivo, dar nu s-a demonstrat că are loc în timpul migrației transendoteliale in vitro.

Mecanisme potențiale implicate în diapedeea transcelulară

Deși este dificil de aplicat abordări mecaniciste riguroase în studiile in vivo, există suficiente dovezi circumstanțiale pentru a susține mai multe mecanisme posibile prin care PMN emigrează transcelular. Este de conceput că porii transcelulari prin care migrează PMN sunt rezultatul deteriorării proteolitice a endoteliului. Cu toate acestea, s-a subliniat faptul că, cel puțin din punct de vedere ultrastructural, endoteliul rămâne nedeteriorat și continuă să formeze caveole și vezicule endocitotice chiar și în regiunile membranare care sunt în contact strâns cu PMN (13). Este mai probabil ca PMN, care par să migreze pe distanțe scurte de-a lungul suprafeței endoteliale apicale, să caute regiuni subțiri ale endoteliului, cum ar fi fenestrele. Fenestrele pot fi deschise (50 nm în diametru) sau subîntinse de o diafragmă de grosimea a două membrane plasmatice (lipsită de citoplasmă). Astfel, PMN ar putea trece cu ușurință prin fenestrele deschise sau ar putea trece proteolitice prin fenestrele cu diafragmă fără a deteriora endoteliul propriu-zis. Fenestrele pot reprezenta o cale importantă de emigrare a PMN în acele organe care conțin microvasile fenestrate (de exemplu, mucoasa gastrointestinală, glandele secretoare).

În organele care conțin microvasile continue (de exemplu, piele, mușchi), PMN poate folosi caveolae sau vezicule pinocitotice și introduce filopode în ele pentru a penetra bariera endotelială. Se crede că aceste structuri, cu un diametru cuprins între 50 și 100 nm, mediază transportul de proteine prin endoteliu și oferă o cale extrajuncțională pentru scurgerile de proteine vasculare în timpul inflamației. Recent, s-a demonstrat că caveolae formează organite veziculo-vacuolare, care pot forma mici pasaje continue legate de membrană prin citoplasma unei celule endoteliale (6). S-a demonstrat că formarea unor astfel de caveole și vezicule continuă în regiunile membranare de la suprafața endotelială care sunt în contact cu PMN care aderă (13). În plus, PMN care aderă îndeaproape la suprafața celulei endoteliale extind adesea filopodii în formă de degete în adânciturile din membrana plasmatică apicală, remodelând astfel suprafața endotelială (4, 7, 8). Forța de proeminență a unui filopodiu care aderă în formarea organitelor veziculo-vacuolare poate duce la apariția acestui filopodiu în partea endotelială abluminală (Fig. 1B), unde poate interacționa ușor cu matricea extracelulară și se poate răspândi de-a lungul acesteia (Fig. 1B).

O concentrație de F-actină și microfilamente în pseudopodiile conducătoare ale PMN a fost demonstrată în timpul diapedezei in vivo (15) și in vitro (3) și poate genera forța necesară pentru a trage procesele celulare care avansează de-a lungul prin porii transcelulari. Porii se pot lărgi până la o dimensiune de 3-5 μm, prin care leucocitele pot trece cu ușurință. Această lărgire a porului vacuolar inițial poate fi realizată, în parte, de forțele generate de tensiunea din sistemul de microfilamente corticale prezente în partea sferică a leucocitelor care încă iese în lumenul vasului. De fapt, a fost observată o concentrație de F-actină în regiunea caudală a PMN-urilor transmigratoare în timpul etapelor târzii ale diapedezei (15). În plus, rearanjarea citoscheletului în citoplasma endotelială poate contribui la lărgirea porului transendotelial, așa cum a fost sugerat anterior (14). Procesul de formare a porului ar fi însoțit de o răspândire a regiunilor apicale ale membranei endoteliale de-a lungul suprafeței celulelor PMN, ceea ce ar duce la eventuala înghițire a porțiunilor PMN luminale de către endoteliu, așa cum a fost demonstrat în micrografiile electronice (Fig 1B). Această participare activă a endoteliului ar ajuta la resigilarea rapidă a căptușelii endoteliale, limitând astfel scurgerea de proteine.

Rezumat

Din această trecere în revistă a dovezilor, este evident că PMN pot folosi atât căi paracelulare cât și transcelulare pentru a traversa bariera endotelială în timpul inflamației. Merită subliniat faptul că migrația transendotelială a PMN in vitro favorizează calea paracelulară, în timp ce migrația transendotelială a PMN in vivo favorizează calea transcelulară. Dacă se presupune teleologic că PMN care transmigrează va alege calea de cea mai mică rezistență, atunci poate exista o explicație pentru discrepanța aparentă dintre rezultatele obținute folosind abordări in vitro și in vivo.

În monostraturile de celule endoteliale crescute în cultură, regiunile cele mai atenuate sunt în apropierea joncțiunilor celulă-celulă și, prin urmare, nu este surprinzător faptul că acesta este locul preferat în care are loc diapedeza. Mai mult, în celulele endoteliale cultivate, joncțiunile intercelulare sunt structuri instabile care sunt în mod constant dezasamblate și reasamblate. O astfel de regiune ar fi ușor accesibilă pentru pseudopodiile leucocitelor transmigratoare. Există, de asemenea, dovezi că, chiar și in vitro, calea paracelulară utilizată de PMN în timpul diapedezei este selectată în mod specific, adică diapedeza are loc preferențial la colțurile tricelulare, mai degrabă decât între două celule endoteliale (1). Joncțiunile Adherens și joncțiunile strânse sunt discontinue la aceste colțuri tricelulare, prezentând astfel calea cu cea mai mică rezistență pentru PMN în transmigrație. În schimb, joncțiunile interendoteliale sunt mult mai bine dezvoltate in vivo și sunt mai rezistente la deplasarea proteinelor prin ele. Astfel, PMN poate utiliza preferențial porii din regiunea subțire a celulelor endoteliale, cum ar fi fenestrele sau caveolae, ca fiind calea de cea mai mică rezistență.

Admiterea căii preferențiale (paracelulară vs. transcelulară) utilizate de PMN în timpul diapedezei în funcție de faptul că au fost utilizate abordări in vitro sau in vivo pentru a studia acest fenomen este, în special, o simplificare excesivă. Există multe exemple de abateri de la această paradigmă. De exemplu, există dovezi care indică faptul că PMN pot utiliza calea paracelulară in vivo și calea transcelulară in vitro. Mai mult, dacă calea transcelulară este cea preferențială pentru diapedeza PMN in vivo, de ce interferența cu proteinele joncționale modifică dramatic diapedeza PMN in vivo? S-ar putea foarte bine ca acest argument să persiste mulți ani de acum încolo, la fel ca și argumentul referitor la faptul dacă mișcarea proteică transendotelială are loc în mod preferențial pe calea paracelulară sau transcelulară. Ne putem imagina că argumentele privind calea de migrare transendotelială a PMN pot fi, în parte, atribuite naturii răspunsului inflamator sau naturii patului vascular în care are loc. Să sperăm că studiile ulterioare vor furniza informații suplimentare care vor permite rezolvarea acestei controverse.

.