Infecția cu complexul Burkholderia cepacia într-o unitate de fibroză chistică la adulți din Madrid | Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

Introducere

Complexul Burkholderia cepacia (BCC) a apărut ca agent patogen semnificativ la pacienții cu fibroză chistică (FC) din cauza riscului de sindrom cepacia (o pneumonie necrozantă fatală cu bacteriemie), multirezistența înnăscută a organismului la antibiotice și transmisibilitatea tulpinilor bacteriene între pacienți prin contact social.1 Contactul strâns și prelungit între pacienții cu FC și folosirea în comun a nebulizatoarelor facilitează dobândirea și transmiterea BCC.2,3 Este dovedit că dobândirea bacteriei BCC este asociată cu spitalizarea și infecția încrucișată prin contact social FC.

Taxonomia genului Burkholderia a suferit mai multe revizuiri majore în ultimele decenii. La mijlocul anilor 1990, s-a demonstrat că tulpinile de „B. cepacia” aparțineau la cel puțin cinci specii diferite, care au fost denumite colectiv complexul B. cepacia.4 Analizele taxonomice ulterioare au arătat că în cadrul BCC erau prezente chiar mai multe specii, iar în prezent au fost descrise 17 specii din complexul B. cepacia4-7: B. cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis, B. vietanmiensis, B. dolosa, B. ambifaria, B. anthina, B. pyrrocinia, B. ubonensis, B. latens, B. diffusa, B. arboris, B. seminalis, B. metallica, B. lata și B. contaminans.8

Cu excepția lui B. ubonensis, toate aceste specii au fost izolate din sputa pacienților cu FC,6,7 cu B. cenocepacia și B. multivorans ca fiind predominante.9

B. cenocepacia este subdivizată în 4 subtipuri (IIIa, IIIb, IIIc și IIId), care sunt codificate de patru alele ale genului recA și există diferențe în ceea ce privește frecvența și virulența tulpinilor. În plus, B. cenocepacia este considerată unul dintre cei mai gravi agenți patogeni, deoarece este frecvent asociată cu o supraviețuire redusă și cu cel mai mare risc de a dezvolta sindromul cepacian fatal.10 Speciile de BCC sunt intrinsec rezistente la multe antibiotice, cum ar fi aminoglicozidele și polimixina B, și adesea necesită terapie combinată pentru a suprima infecția în FC.11

Infecțiile cu bacterii BCC la pacienții cu fibroză chistică sunt adesea corelate cu o morbiditate și o mortalitate crescute, iar rezistența înnăscută a acestor organisme la o gamă largă de antibiotice complică tratamentul pacienților infectați.12,13 Această rezistență este cauzată de diverse mecanisme, inclusiv permeabilitatea limitată, modificări ale structurii lipopolizaharidelor și prezența mai multor pompe de eflux multidrog, beta-lactamaze cromozomiale inductibile și proteine modificate de legare a penicilinei. În plus, formarea in vitro a biofilmului a fost descrisă pentru mai multe tulpini din complexul B. cepacia și acest lucru poate contribui la capacitatea lor de a supraviețui în mediul pulmonar al FC, oferind o protecție suplimentară împotriva antibioticelor.14-16

Tratamentul pacienților infectați cu BCC trebuie să se bazeze de preferință pe rezultatele testelor de sensibilitate și include adesea o terapie combinată cu două sau trei antibiotice care prezintă o activitate sinergică.12,17,18Studiile de sensibilitate in vitro asupra tulpinilor de BCC arată că concentrațiile limită de ceftazidimă, ciprofloxacină, meropenem, tetracicline sau doze mari de tobramicină au o activitate bacteriostatică împotriva unei fracțiuni considerabile din aceste tulpini.19-21 În consecință, aceste antibiotice sunt adesea utilizate pentru a trata pacienții cu FC infectați cu BCC. În plus, cotrimoxazol este încă frecvent utilizat în tratamentul infecțiilor cronice cu BCC, deși testele de sensibilitate ale acestor antibiotice complementare au evidențiat o activitate slabă împotriva multor tulpini de BCC.18,22

Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua izolatele și susceptibilitatea BCC și de a analiza repercusiunile clinice.

Metode

Asputa pacienților cu FC a fost analizată pentru izolatele finale de BCC, la unitatea de FC pentru adulți din Spitalul La Princesa care funcționează din martie 1997. Aceste probe au fost procesate în departamentul de microbiologie în procedura standard23; am utilizat mediul selectiv specific și streak-ul cantitativ, folosind procedura convențională de diluție în serie pentru probă. Sputa a fost supusă pe un proces de omogenizare cu N-acetilcisteină înainte de punerea în cultură. În laboratorul nostru, mediile de cultură utilizate au fost: agar sânge, agar ciocolată cu bacitracină, agar manitol-sare, agar MacConkey, agar Sabouraud cloranfenicol și mediul selectiv pentru B. cepacia numit BCSA (Biomèrieux). Durata de incubare a plăcilor a fost de 3 până la 5 zile la 35°C. Agarul ciocolată cu bacitracină a fost incubat în atmosferă de CO2.

Identificarea preliminară a tulpinilor de BCC a fost realizată cu ajutorul MicroScan (Siemens) și Api 20 NE (Biomerieux). Aceste proceduri au fost efectuate în conformitate cu recomandările producătorului.24

Subiectiv, tulpinile au fost retrimise la Centro Nacional de Microbiología (Majadahonda, Madrid) pentru confirmarea și determinarea speciei și a genospeciei. Pentru acest studiu, au fost efectuate următoarele metode: Api 20 NE (biomerieux, Marcy l’Etoile) și GN2 Microplate (BIOLOG, Hayward, CA) și metode moleculare. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu recomandările producătorului.

Extracția ADN cromozomal

Extragerea ADN-ului a fost efectuată cu kitul comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, GmbH, Hilden, Germania), conform instrucțiunilor producătorului.Analiza PCR

Amplificarea genelor a fost efectuată într-un volum final de 25μl, utilizând kitul PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Regatul Unit) și conținând 5μl de ADN extras și 10pmol din fiecare primer: fD1 și rP225 pentru ADNr 16S și BCR1 și BCR426 pentru recA. Ciclul termic a fost efectuat într-un TaKaRa PCR Thermal Cycler v. III mod TP600 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Shiga) în următoarele condiții pentru ADNr 16S: 94°C timp de 5 minute pentru primul ciclu, 35 de cicluri de 15 secunde la 94°C, recoacere timp de 15 secunde la 55°C și prelungire la 72°C timp de 1 minut și 50 de secunde. Condițiile de amplificare a recA au fost următoarele: 94°C timp de 5min, 30 de cicluri de 30s la 94°C, recoacere timp de 45s la 55°C și prelungire la 72°C timp de 10min.

Am vizualizat 2μl din fiecare produs PCR prin electroforeză pe gel de agaroză cu concentrația de agaroză ajustată la 1,5% și folosind tampon TAE 1×. Markerii de dimensiune moleculară au fost incluși pe toate gelurile: Marker X 0,07-12,2kbp (Roche Applied Sciences, Mannheim, Germania) și GeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germania) pentru produsele 16s rDNA și, respectiv, recA.

Străinele identificate ca fiind B. cenocepacia au fost supuse metodei PCR cu primeri specifici pentru grupul RecA-IIIA (BCRG3A1 și BCRG3A2) și RecA-IIIB (BCRG3B1 și BCRG3B2) în condițiile descrise anterior.24

Zece μl de produse PCR au fost vizualizate prin electroforeză pe gel de agaroză în aceleași condiții descrise mai sus.

Analiza secvenței nucleotidice

Produsele PCR ADNr16s și RecA au fost secvențiate folosind fD1 și rP2 și, respectiv, BCR1 ca primeri. Reacțiile de secvențiere au fost pregătite cu ajutorul Big Dye Terminator v 3.1 (Applied Biosystem, SUA) într-un volum final de 10μl în conformitate cu instrucțiunile producătorului și au fost analizate cu sistemul de electroforeză capilară ABI PRISM 3100 genetic analyzer (Applied Biosystem, SUA). Secvențele au fost asamblate cu ajutorul software-ului SeqMan 3.61 (DNA Star, Inc, Madison, WI, SUA). Analiza a implicat, de asemenea, utilizarea instrumentului Basic Local Alignment Search Tool (BLAST: www.ncbi.nlm.nih.gov) pentru a stabili identitatea corectă a genelor.

Analiză PFGE

Relația dintre tulpini a fost analizată prin electroforeză pe gel în câmp pulsat (PFGE). Pregătirea dopurilor, liza, spălarea celulelor și digestia de restricție au fost efectuate așa cum au fost descrise anterior25,26 cu mici diferențe. S-a utilizat enzima de restricție XbaI (40U, Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germania). PFGE a fost realizată în conformitate cu protocolul descris pentru Stenotrophomonas maltophilia de Valdezate et al.27 și utilizând DRIII Chef System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, SUA) și concetățeni de fag lambda (Biolabs, New England, Regatul Unit) ca marker de greutate moleculară. Imaginile au fost obținute cu software-ul Quantity One v. 4.6.1 (BioRad). Analiza imaginilor a fost efectuată vizual, iar izolatele au fost considerate ca fiind indistinctibile din punct de vedere genotipic dacă prezentau un model de benzi identic.

Sensibilitatea la antibiotice a fost realizată prin microdiluție cu MicroScan și difuzie pe disc simultan. Ambele metode au fost considerate puncte de rupere CLSI.28 Pentru ciprofloxacină și imipenem, au fost utilizate punctele de rupere ale levofloxacinei și, respectiv, ale meropenemului. Au fost studiate următoarele antibiotice: ceftazidimă, ciprofloxacină, levofloxacină, cotrimoxazol, minociclină, imipenem și meropenem.

Pacienții cu BCC au fost studiați cu următoarele variabile: vârsta (la început și în prezent), sexul, greutatea (la început și în prezent), mutația genului Cystic Fibrosis Transmembrana Regulator, evoluția funcției respiratorii care a fost determinată de procentul conform valorii teoretice a volumului expirat în prima secundă (FEV1) de la prima lor izolare, precum și punctuațiile radiologice de la Brasfield și clinicile de la Shawchman la începutul izolării BCC și în prezent.

A fost evaluată co-colonizarea cu alte microorganisme.

Scorecția Brasfield a fost evaluată cu 0-5 (de la mic la mare) în funcție de semnele radiologice: captarea de aer, umbre liniare, leziuni chistice nodulare, consolidare segmentară sau lobară și impresia generală a severității. Punctuația globală obținută a fost sustrasă la 25. Cea mai mică valoare obținută a corespuns unei radiologii mai severe. Radiologia toracică și corespondentul ei, scorul Brasfield, au fost efectuate în fiecare an.

Scorul clinic Shwachman a evaluat 4 itemi cu punctuație maximă de 25 fiecare: activitate generală, examen fizic, creștere și nutriție și radiografie toracică. Punctuația ideală a fost 100, iar starea pacienților a fost clasificată în funcție de punctuație: excelentă (86-100 puncte), bună (71-85 puncte), ușoară (56-70 puncte), moderată (40-55 puncte) sau gravă (mai mică sau egală cu 40).

Rezultate

CBC a fost izolat la 12 din 70 de pacienți adulți cu FC (17,1%) pe parcursul a 10 ani. Doi dintre pacienți au avut un transplant de plămâni, unul dintre ei a murit după transplant, iar la celălalt, BCC a fost eradicat în 2005 înainte de transplantul care a fost în 2011. BCC a fost eradicat la celălalt pacient în 2009. Acești pacienți au fost studiați doar pentru câteva luni, astfel încât evoluția clinică nu a fost înregistrată. B. cenocepacia a fost izolată la 4 pacienți (33,3%), B. contaminans la 3 pacienți (25%), B. stabilis la 2 pacienți (16,7%), B. vietnamiensis la 2 pacienți (16,7%), B. cepacia la un pacient (8,3%), B. multivorans la un pacient (8,3%) și B. lata la un pacient (8,3%). Dintre B. cenocepacia, subtipul IIIa a fost identificat la doi pacienți din 4 (50%), iar subtipul IIIb la ceilalți doi pacienți (50%). Un pacient a avut la început B. cenocepacia și apoi a avut un B. lata. În mod similar, un alt pacient a avut B. stabilis și apoi a avut B. contaminans. În studiul nostru, 50% dintre pacienții cu BCC au avut tulpini de Staphylococcus aureus (tabelul 1).

Analiza PFGE arată că aceeași tulpină a fost izolată la fiecare pacient cu FC, dar a fost diferită între pacienți, astfel încât acest lucru certifică faptul că nu a existat transmitere încrucișată.

90% dintre BCC au fost sensibile la meropenem, 80% la cotrimoxazol, 60% la minociclină, 50% la ceftazidimă și 40% la levofloxacină, 20% la ciprofloxacină și 10% la imipenem.

50% dintre pacienții cu FC au fost de sex masculin, iar vârsta medie la care acești pacienți au avut prima izolare de BCC a fost de 24,4 ani (SD: 7,71). Cei 41,7% dintre pacienți au avut mutația F508del/alte mutații, 33,3% au avut mutația F508del/F508 și 25% au avut alte mutații/alte mutații.

La început a fost calculat scorul Brasfield și Shwachman pentru toți pacienții incluși în acest studiu, iar punctajul mediu a fost de 18,6 și 82,3. Cu toate acestea, scorul Brasfield și Shwachman actual este realizat cu pacienții colonizați. Punctuația medie a fost de 21,1 și 81. Doar 1 pacient avea diabet și 6 pacienți aveau insuficiență pancreatică. Tabelul 2 prezintă caracteristicile clinice ale pacienților cu FC care au avut BCC.

Fig. 1 prezintă evoluția funcției pulmonare (%FEV1) a pacienților care au avut mai mult de un izolator de BCC.

Fig. 1.

Evoluția funcției pulmonare a pacienților cronici cu FC de la prima izolare a BCC în spută.

(0,1MB).

Discuție

Există puține studii legate de evoluția clinică a pacienților cu o specie izolată de BCC și există o idee generală că specia B. cenocepacia este asociată cu o morbiditate și mortalitate mai mare la pacienții cu FC.19 Prin urmare, nu există multe date recente despre pacienții cu BCC în Spania. Un studiu realizat în Spitalul Universitario de Cruces arată o creștere a incidenței colonizării cu BCC.29

Este important ca identificarea speciilor de BCC să fie realizată într-un centru specializat, deoarece facultativele ajută la supravegherea unei monitorizări atente a acestor pacienți care sunt colonizați de aceste specii, deoarece pot evolua negativ.

Un studiu realizat de Van Pelt et al.30 arată că API 20 NE a fost mai precis decât MicroScan. 90% din izolate au fost identificate corect folosind API 20NE față de 68% folosind MicroScan. Aceștia sugerează utilizarea plăcilor BCSA pentru izolarea inițială a B. cepacia direct din materialul clinic. Sensibilitatea acestor medii de creștere a părut a fi excelentă (96%); specificitatea nu a fost de 100%. A fost destul de frapant să se constate că pentru testele automate, precum MicroScan, precizia a fost insuficientă. Rezultatul major al prezentei analize este faptul că identificarea moleculară prin analiza PCR-RFLP este superioară procedurilor biochimice și microbiologice de identificare a speciilor, deși trebuie subliniat faptul că rezultatele obținute cu API20 NE au fost satisfăcătoare.30

În studiul nostru, B. cenocepacia, B. contaminans, B. vietnamiensis, B. stabilis, B. multivorans, B. cepacia și B. lata au fost izolate din secrețiile respiratorii ale celor 12 pacienți cu FC examinați, iar B. cenocepacia a fost specia cea mai răspândită, la fel ca majoritatea datelor descrise în literatura europeană despre pacienții cu FC.19 Cu toate acestea, această descoperire nu este în concordanță cu un studiu din Portugalia (Susana Correia et cols), în care cele mai frecvente specii au fost B. cepacia 57% și B. stabilis 13%. Poate că se datorează utilizării de soluții saline nesterile contaminate intrinsec cu B. cepacia.19 Aceste soluții contaminate au fost detectate de Infarmed în timpul unei inspecții microbiologice de rutină.19 În studiul nostru, B. cepacia și B. stabilis au fost izolate în proporție mai mică, la fel ca în alte studii din Europa și America.19

Între izolările de B. cenocepacia, a existat aceeași proporție între B. cenocepacia subtipurile IIIa și IIIb.

Unul dintre pacienți a avut B. cenocepacia ca primă izolare, B. lata ca a doua izolare și apoi a fost eradicat. Un alt pacient a avut B. vietnamiensis în 2004 care a fost eradicat, iar transplantul pulmonar a fost făcut la el în 2011, iar un alt pacient a fost izolat cu B. cenocepacia subtip IIIa în 2004, dar a murit în același an după un transplant pulmonar. Rezultatele supraviețuirii transplantului pulmonar sunt cele mai proaste la pacienții care sunt colonizați cu B. cenocepacia, astfel că unele unități de transplant contraindică transplantul în acest caz. A fost recunoscut faptul că B. cenocepacia are un prognostic mai prost în comparație cu B. multivorans, cu o supraviețuire mai scurtă atunci când este comparată cu martorii Pseudomonas aeruginosa.31 Sindromul Cepacia a fost raportat cu ambele specii.26 Fiziopatologia exactă a acestui sindrom este prost înțeleasă, iar rata exactă a mortalității nu este cunoscută, deși se crede că se apropie de 100%.32

Pacienții noștri au valori scăzute ale FEV1. Un număr mare de pacienți se deterioraseră deja înainte de izolarea BCC, ca urmare a colonizării cu alți agenți patogeni și a progresiei bolii. La pacienții stabili din punct de vedere clinic nu au fost observate modificări semnificative ale valorilor FEV1 și ale stării nutriționale. Există dovezi că este posibil ca colonizarea pulmonară să nu fie detectată prin culturi standard pentru o anumită perioadă de timp (până la 2 ani) după achiziționarea BCC.33 În plus, nu este clar dacă, în cazurile de izolare intermitentă, există o reinfectare cu o tulpină nouă sau dacă există o recrudescență a tulpinii inițiale.20 În majoritatea cazurilor din diferitele noastre izolări, nu s-a observat nicio înlocuire a tulpinilor inițiale de BCC.

S-au înregistrat cazuri în care aceeași tulpină (cu același genotip), care a infectat în mod persistent un pacient timp de mai mulți ani, a fost eradicată prin terapie cu antibiotice sau nu a avut niciun impact aparent asupra tabloului clinic al altor pacienți. Nu este clar de ce tulpinile diferitelor specii de BCC diferă în ceea ce privește persistența, epidemiologia și potențialul patogen în FC și de ce aceleași tulpini pot fi asociate unor evoluții clinice foarte diferite.19 Depinde de factori inerenți fiecărui pacient în parte, de co-colonizarea cu alți agenți patogeni și de alți factori care încă nu au fost identificați, subliniind importanța realizării unor studii de acest tip.19

Rezistența la antibiotice este considerată un factor de virulență important al organismelor BCC.14 Deși terapia este de obicei ghidată de testele de susceptibilitate antimicrobiană, eradicarea organismelor BCC este rareori obținută.21 Au fost formulate multiple ipoteze pentru a explica acest eșec, inclusiv concentrații inadecvate de antibiotic sau inactivarea antibioticului în spută, afectarea apărării gazdei la pacienții cu FC, formarea de biofilme, efectul „inoculum” și rata de creștere in vivo a acestor organisme.34

Elke et al. au raportat într-un studiu din Belgia că meropenemul, minociclina și ceftazidima au fost cele mai active antibiotice împotriva izolării BCC, iar ciprofloxazina și trimetoprima/sulfametoxazol au avut cea mai scăzută activitate.35 Cu toate acestea, studiul nostru a constatat că meropenemul a fost cel mai activ, cu o sensibilitate de 90%, urmat de trimetoprim/sulfametoxazol, minociclină și ceftazidimă cu 80%, 60% și, respectiv, 50%. Deși organismele BCC sunt de obicei rezistente la aminoglicozide, dozele mari de tobramicină au inhibat majoritatea tulpinilor testate. Tobramicina nebulizată, care produce concentrații maxime ridicate în spută, este din ce în ce mai mult utilizată pentru tratarea pacienților cu FC.36-38

În consecință, aceste concentrații mai mari trebuie luate în considerare la evaluarea utilității acestui antibiotic.35 Mai multe rapoarte confirmă faptul că tobramicina nebulizată este foarte promițătoare în tratamentul pacienților cu FC infectați cu BCC: de exemplu, Weidmann și colab.39 au descris recent eradicarea completă a organismelor BCC din plămânii pacienților cu FC prin utilizarea unei combinații de tobramicină nebulizată și amiloridă. În plus, o terapie combinată cu meropenem și tobramicină nebulizată și intravenoasă a dus, de asemenea, la tratarea cu succes a unei paciente cu FC care suferea de sindrom cepacia, deși probele de spută ale acestei din urmă paciente au rămas pozitive pentru B. cenocepacia.39

Speciile BCC sunt intrinsec rezistente la multe antibiotice, cum ar fi aminoglicozidele și polimixina B, și necesită adesea o terapie combinată pentru a suprima infecția în FC.11 Antibioticele polimixină, gentamicină și vancomicină sunt utilizate la concentrații ridicate în B. cepacia Selective Agar, un mediu foarte eficient pentru izolarea lor din sputa CF.11 Nzula și colab.13 au comparat sensibilitatea la antibiotice a șase specii de BCC și au concluzionat că aceasta a fost foarte variabilă, cu excepția rezistenței înnăscute la polimixină, și că nu este legată de statutul taxonomic al izolatelor examinate. Effluxul, secreția de beta-lactamaze cromozomiale și impermeabilitatea învelișului exterior al bacteriilor BCC au fost implicate în rezistența la antibiotice.14

În schimb, baza moleculară a rezistenței la biocide a bacteriilor BCC a fost puțin studiată, în ciuda faptului că aceste organisme sunt legate de multe cazuri de contaminare cu dezinfectanți și alte soluții antiinfecțioase.40

Misiunea și, prin urmare, provocarea reprezentată de identificarea speciilor de BCC pentru laboratoarele de microbiologie clinică de rutină sunt diferite. Tulpinile izolate pe medii selective și identificate provizoriu ca aparținând BCC cu ajutorul sistemelor comerciale trebuie confirmate cu ajutorul testelor biochimice clasice descrise.41

Detecția precoce a BCC este extrem de importantă atât pentru pacientul cu FC, cât și pentru comunitatea FC. Cu toate acestea, un studiu recent5 a indicat faptul că mai puțin de jumătate din centrele din S.U.A. chestionate utilizează medii selective specifice „B. cepacia” sau incubează culturile pentru perioade îndelungate, ambele măsuri îmbunătățind randamentul acestui organism. Utilizarea acestor tehnici de cultură actualizate nu este solicitantă din punct de vedere tehnic și ar trebui să fie standardul de îngrijire așteptat în fiecare centru de FC din întreaga lume.

În acest studiu, am eradicat B. cenocepacia doar la un singur pacient; un alt pacient a murit imediat după transplant și niciunul dintre pacienți nu a avut sindromul cepacia și nu a suferit o deteriorare clinică importantă, deși perioada de observație a fost scurtă, deoarece au dobândit BCC recent.

Diagnosticul îmbunătățit al infecțiilor cauzate de membri ai BCC și de alte organisme asemănătoare B. cepacia va ajuta la interpretarea rezultatelor studiilor privind rezultatele clinice și, prin aceasta, va furniza informații cruciale cu privire la patogenitatea și/sau transmisibilitatea tulpinilor specifice implicate.5

Conflict de interese

Niciunul dintre autori nu are de declarat vreun conflict de interese.

.