Articles / octombrie 16, 2021

Improved Dynamic Light Scattering using an adaptive and statistically driven time resolved treatment of correlation data

În această lucrare descriem și evaluăm un nou proces de măsurare DLS și de tratare a datelor care taie datele privind timpul de sosire a fotonilor de la detector în blocuri foarte mici, fiecare dintre acestea fiind corelat ca o sub-măsurare separată. Distribuția statistică a unui număr de mărimi derivate din fiecare sub-măsurare corelată, construită în timpul procesului de măsurare, este apoi utilizată pentru a clasifica evenimentele tranzitorii, cum ar fi cel prezentat la sfârșitul sub-măsurării de 10 s, între 8 s și 10 s în Fig. 1b, și pentru a le analiza separat față de restul datelor de stare stabilă (de la 0 s la <8 s în Fig. 1c). Rezultatul este apoi însumat separat sub forma unei perechi de corelograme în regim tranzitoriu și în regim staționar, care sunt apoi reduse pentru a obține distribuțiile dimensionale ale particulelor în regim tranzitoriu și în regim staționar. În mod esențial, deoarece toate datele colectate (tranzitorii și staționare) sunt analizate și raportate: nicio dată nu este respinsă sau ascunsă utilizatorului și se obține o reprezentare completă și fără distorsiuni a rezultatelor oricărui eșantion, polidisperse sau nu, dar fără incertitudinile crescute ale fracțiilor de interes în stare staționară în prezența unor difuzoare tranzitorii puternice. Mai mult, acest procedeu tratează în mod intrinsec cazul limită în care există atât de multe agregate încât fracția primară a eșantionului ar trebui să fie considerată ca fiind aceste componente mai mari, adică agregatele devin atât de numeroase încât semnalul lor devine fracția de stare staționară27.

Am constatat, de asemenea, că clasificarea și reducerea separată a claselor de stare tranzitorie și de stare staționară pe baza unor subcursuri de măsurare foarte scurte și într-o manieră bazată pe statisticile datelor în sine, conduce la o minimizare relevantă din punct de vedere statistic a variabilității în cadrul clasei de stare staționară pe parcursul unor timpi de măsurare totali scurți, ceea ce conduce direct la o creștere a preciziei datelor DLS de stare staționară, reducând în același timp timpul total de măsurare pentru un eșantion cu un comportament bun, cu un ordin de mărime față de cele întâlnite în prezent în instrumentele disponibile în comerț.

Dezvoltarea tehnicii este descrisă în restul acestei secțiuni folosind măsurători ale particulelor de latex de polistiren ca sistem model de dimensiuni cunoscute și dispersii de lizozimă ca eșantion fragil, cu dispersie redusă. În secțiunea 3 sunt descrise o serie de studii de caz care demonstrează beneficiile tehnicii, iar în secțiunea 4 sunt prezentate concluziile, iar în secțiunea 5 sunt descrise metodele utilizate.

Metode de analiză

Chiar dacă tehnica este la fel de aplicabilă măsurătorilor cu corelație încrucișată, majoritatea instrumentelor disponibile în comerț măsoară funcția de autocorelație g2(|q|;τ) a seriei de timp I(t) a fotonilor detectați și împrăștiați, dată de,

$${g}^{2}}(|{\boldsymbol{q}}|;\tau )=\frac{\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t){\rangle }^{2}}$$

(3)

unde τ este timpul de întârziere, iar I este intensitatea măsurată la detector în număr de fotoni pe secundă măsurată la momentul t. Funcția de corelație de ordinul întâi, g1, este obținută din g2 prin intermediul relației Siegert1 și, în mod obișnuit, se implementează un cumulant-fit20 pentru g1, astfel încât,

$${g}^{1}(|{{\boldsymbol{q}}|;\tau )=exp(-\bar{\Gamma }(\tau -\frac{{\mu }_{2}}{2!}{\tau }^{2}+\frac{{{\mu }_{3}}}{3!}{{\tau }^{3}+\ldots ))$$

(4)

unde, $\bar{\Gamma }\,$ este rata medie, caracteristică de dezintegrare pentru toate clasele de mărime din eșantion și ${\mu }_{2}/{\bar{\Gamma }}}^{2}\,$ este indicele de polidispersitate de ordinul 2 (PdI), care descrie abaterea funcției de corelație de la o descreștere exponențială unică, oferind o estimare a varianței eșantionului. Coeficientul de difuzie mediu z, Dz, este apoi dat de relația

$$\bar{\Gamma }={|{{\boldsymbol{q}}|}^{2}{D}_{z}$$$

(5)

și diametrul hidrodinamic mediu, ZAve, calculat din Dz, folosind modelul Stokes-Einstein pentru particule sferice în lichide cu număr Reynolds scăzut, Ec. 6, unde η este vâscozitatea dispersantului, kB, constanta Boltzmann și T, temperatura dispersantului în Kelvin,

$${D}_{z}=\frac{{k}_{B}T}{3\pi \eta {Z}_{Ave}}$$

(6)

O estimare a distribuției dimensionale a particulelor la o rezoluție mai mare decât cea a cumulanților este dată de ajustarea funcției de corelație la o sumă peste exponențiale multiple, realizată printr-o serie de metode de inversie posibile, cum ar fi CONTIN28 sau metoda celor mai mici pătrate non-negative (NNLS), care sunt două exemple implementate în mod obișnuit, concepute pentru a face față naturii în general nepotrivite a unei astfel de ajustări. Pentru cazul polidispersiilor, ecuația Eq. 4 devine atunci o distribuție continuă pe D, din care se poate calcula o gamă de raze sau diametre ale particulelor contribuitoare,

$${g}^{1}(|{\boldsymbol{q}}|;\tau )=\int G(\Gamma )\,exp(\,-\,\Gamma {\rm{\tau }})d\Gamma $$

(7)

Lungime de sub-măsurare și precizie îmbunătățită

Seria de timp de sosire a fotonilor este împărțită în mici sub-măsurători care sunt apoi corelate individual și reduse în proprietăți ale eșantionului, așa cum este descris în secțiunea 2.1 și distribuțiile acestor mărimi derivate, construite pe măsură ce măsurarea avansează, sunt apoi folosite pentru a identifica datele tranzitorii și cele în stare staționară.

Incertitudinea experimentală a mărimilor derivate din datele DLS (ZAve, PdI, rata de numărare etc.) pe măsurători multiple este invers proporțională cu rădăcina pătrată a numărului de măsurători în mod obișnuit, cu toate acestea, relația dintre zgomotul din corelograma din cadrul fiecărei submăsuri și lungimea submăsurilor este mai puțin evidentă. Reamintind figura 1a, volumul eșantionat, adică regiunea delimitată de intersecția dintre traiectoria laserului de iluminare și traiectoria de detecție, ambele de lățime finită, este semnificativ mai mic decât volumul total al probei din cuvă, prin urmare, pe măsură ce timpul de integrare crește, crește probabilitatea ca un agregat să difuzeze în volumul de detecție sau să iasă din acesta, iar în această secțiune se analizează modul în care se comportă mărimile derivate, ZAve și PdI, în funcție de durata sub-măsurării. Scopul este de a optimiza durata pentru a menține sau a îmbunătăți raportul semnal-zgomot, dar cu o durată de sub-măsurare care să permită în același timp algoritmului de selecție să rămână suficient de receptiv pentru a clasifica fiecare sub-măsurare ca fiind în stare stabilă sau tranzitorie.

Figura 2a prezintă ZAve și PdI pentru o serie de măsurători ale unui latex de polistiren cu un interval de dimensiuni hidrodinamice specificat de producător ca fiind de 58-68 nm (Thermo-Scientific, 3060 A), dispersat în NaCl 150 mM realizat cu apă DI filtrată de 200 nm (18.2 MΩ).

Notați reducerea abaterii standard asupra ZAve măsurate de la 1.1 nm la 0,32 nm între cazurile 1 × 10 s și 10 × 1 s, evidențiată în albastru, ceea ce indică faptul că precizia măsurătorii DLS este crescută prin simpla utilizare a unei medii asupra unor sub-măsurători mai scurte, dar pentru același timp total de integrare. Un comportament similar poate fi observat în măsurătorile particulelor de dimensiuni diferite (a se vedea informațiile suplimentare).

Mecanismul care stă la baza acestei îmbunătățiri poate fi explicat prin luarea în considerare a formei funcției de corelație atunci când se detectează un difuzor tranzitoriu. Funcția de corelație este aproximativ o descreștere exponențială, cu mici perturbații datorate mai multor surse de zgomot, inclusiv după pulsații, zgomot de împușcare, erori de normalizare și, bineînțeles, detectarea particulelor difuzante de dimensiuni diferite21. Înregistrarea împrăștierii luminii corelate pe intervale scurte de timp poate crește amplitudinea acestor perturbații, dar calcularea mediei pe mai multe funcții de corelație de sub-măsurare, fiecare conținând zgomot aleatoriu, înseamnă că rezultatul final conține mai puțin zgomot decât o funcție de corelație înregistrată pe aceeași durată, dar tratată ca o singură urmă continuă. Acesta este un rezultat extrem de important, deoarece indică faptul că nimic mai mult decât o durată de sub-măsurare derivată cu atenție produce o îmbunătățire de 3 ori a preciziei pentru această modalitate primară de măsurare la scară nanometrică.

În plus, așa cum arătăm în secțiunea următoare, lungimea mai scurtă de sub-măsurare permite, de asemenea, clasificarea datelor în regim staționar și tranzitoriu, ceea ce vom demonstra că rezolvă o critică primară a DLS: proporționalitatea intensității împrăștiate cu puterea a șasea a razei particulelor, ceea ce înseamnă că datele din componenta primară a particulelor pot fi distorsionate sau chiar mascate de prezența unor particule mari rare. În termeni practici, acest lucru impune necesitatea unei pregătiri scrupuloase a eșantioanelor pentru a evita incertitudinile semnificative în rezultatul măsurătorilor cauzate de fracțiuni mai mari, adesea nedorite, provenite, de exemplu, din reziduuri de filtrare, agregate tranzitorii sau vase de laborator prost curățate.

Clasificarea datelor tranzitorii și a celor în stare staționară

După cum s-a afirmat anterior, multe instrumente DLS comerciale utilizează un timp de sub-măsurare de ordinul a 10 secunde, mai multe dintre aceste măsurători fiind combinate după o anumită formă de algoritm de respingere a prafului, ceea ce înseamnă însă că secțiuni mari de date fiabile pot fi omise dintr-o măsurătoare dacă o sub-măsurare conține o scurtă rafală de împrăștiere de la un eveniment tranzitoriu. Acest lucru sugerează că o clasificare a datelor de stare stabilă și a celor tranzitorii ar putea fi obținută, de asemenea, prin utilizarea unor timpi de corelație mai scurți, ceea ce ar putea face, de asemenea, ca comparația între sub măsurători să fie mai precisă, deoarece efectele împrăștierii tranzitorii nu ar fi mediate. Rezultatele unei serii de aceste sub-măsurători ar putea fi apoi combinate prin analizarea mediei funcțiilor de autocorelație înainte de a efectua analiza mărimii, așa cum se discută în secțiunea 2.2.

Toate sub-măsurătorile înregistrate sunt apoi clasificate în seturi care descriu starea de echilibru și tranzitorii ale sistemului sau, cu alte cuvinte, cele care sunt reprezentative pentru eșantionul de bază, în stare stabilă, și cele care sunt asociate cu o explozie de dispersie spontană, așa cum se arată în Fig. 1c.

Identificarea sub-măsurilor tranzitorii ar trebui să fie derivată din caracteristicile eșantionului investigat pentru a evita necesitatea unor praguri definite în mod arbitrar care pot fi specifice eșantionului. Prin reducerea individuală a fiecăreia dintre submăsurătorile colaționate, sunt disponibili o serie de parametri posibili care pot fi folosiți ca bază pentru compararea seturilor de submăsurători și pare logic să se bazeze această comparație pe o analiză a mărimii funcțiilor de autocorelație măsurate.

Analiza cumulanților presupune că un eșantion este monodispersat, ceea ce înseamnă că atât ZAve cât și PdI vor oferi măsuri continue și sensibile ale mărimii particulelor pe care le putem folosi pentru a compara submăsurătorile. PdI descrie abaterea funcției de corelație de la o descreștere exponențială perfectă. Este o măsurătoare directă a perturbării funcției de corelație și este deosebit de sensibilă la zgomotul din linia de bază a funcției de corelație, care este o consecință tipică a împrăștierii tranzitorii și, după cum vom arăta, este, prin urmare, un parametru ideal de utilizat pentru a compara funcțiile de corelație de la o pluralitate de sub-măsurători.

Un exemplu al unei astfel de relații este prezentat în Fig. 2b, unde probele conțin fie material agregat, fie sunt dopate cu un amestec de sfere de latex (a se vedea informațiile suplimentare). Aici, eșantioanele care conțin urme de agregate prezintă o corelație pozitivă între dimensiunea măsurată și PdI, cu unele puncte de date grupate la o dimensiune și PdI consistente, în timp ce eșantioanele ne-dopate prezintă grupuri de date bine definite. Prin urmare, sub măsurătorile tranzitorii pot fi identificate ca fiind cele care se prezintă la o valoare neașteptată pentru PdI. În acest caz, neașteptat înseamnă că PdI a unei anumite submăsurători nu este reprezentativă pentru submăsurătorile în stare stabilă și, prin urmare, este o valoare statistică aberantă. Există multe metode de identificare a valorilor statistice aberante, fiecare dintre acestea având puncte forte și puncte slabe în funcție de natura distribuției de interes și de mărimea eșantionului.

Figura 3a prezintă distribuțiile PdI pentru dispersii care conțin cantități arbitrar de mici cantități de material fals, cu distribuții ale PdI care variază în centru și în lățime pentru diferitele eșantioane. Având în vedere că PdI este limitată, prin definiție, la interval și, în general, va fi înclinată spre valori mai mari, descriptorii aritmetici ai distribuției, cum ar fi media și abaterea standard, nu sunt adecvați.

Dacă numărul de sub-măsurători discrete este suficient de mare, se poate utiliza o histogramă a datelor pentru a obține o lățime de distribuție (a se vedea ajustările gaussiene din Fig. 3a), cu toate acestea, atunci când dimensiunea eșantionului este mai mică, metodele numerice de testare a ipotezelor, cum ar fi cele descrise de Dixon29 și Rosner30 , pot fi mai adecvate, Fig. 3b.

Optimizarea dimensiunii eșantionului

Eficiența oricărei metode de identificare a valorilor aberante va fi cuplată atât la numărul total de puncte de date, cât și la numărul de valori aberante din cadrul unei distribuții. De exemplu, proba bine preparată, monodispersă și stabilă prezentată în figura 2a demonstrează că o dimensiune fiabilă poate fi raportată pentru doar 10 submăsurători medii cu durata de 1 s, în timp ce o probă care produce funcții de corelație mai zgomotoase, fie printr-o dispersie scăzută, fie printr-o polidispersitate semnificativă sau prin faptul că conține dispersori nepotriviți, va necesita un număr mai mare de submăsurători pentru a oferi mai multă încredere în identificarea valorilor aberante. Din nou, acest lucru motivează o abordare bazată pe eșantion, prin care numărul de submăsurători răspunde la calitatea datelor colectate din eșantion.

Abordări posibile ar putea fi monitorizarea răspândirii rezultatelor submăsurătorilor individuale sau efectuarea de teste de normalitate asupra acestor valori, însă acest lucru ar determina, de obicei, ca măsurătoarea să achiziționeze un număr mai mare de puncte de date. O abordare alternativă este monitorizarea continuă a rezultatului final presupus a fi final pe măsură ce măsurarea avansează, în cazul în care statisticile măsurării sunt bine definite în mod corespunzător, iar perturbațiile din funcția de corelație sunt bine mediate în mod corespunzător din rezultatul final, mărimea raportată ar trebui să devină constantă până la un anumit grad de variație naturală. Din nou, se pot utiliza teste de ipoteză pentru a compara rezultatul care ar urma să rezulte din măsurare după colectarea de sub-măsurători suplimentare, iar dacă aceste valori sunt în concordanță, atunci eșantionul este caracterizat în mod adecvat, iar măsurarea se poate încheia în consecință. Acestei metode i se poate adăuga și mai multă încredere prin verificarea cauzelor speciale ale rezultatelor pe parcursul măsurătorii, cum ar fi tendințele și oscilațiile.

Un exemplu al acestei abordări este prezentat în Fig. 4a pentru o probă de lizozimă, cu o subestimare inițial eronată a mărimii particulelor raportată, dar care se stabilizează odată cu colectarea măsurătorilor secundare ulterioare. Rețineți, de asemenea, că identificarea valorilor aberante se repetă în timpul măsurătorii, pe măsură ce se colectează mai multe date, ceea ce înseamnă că un eveniment tranzitoriu va fi identificat ca atare, indiferent de momentul în care a fost înregistrat în procesul de măsurare. Aceasta este o îmbunătățire față de alte metode care pot compara datele pe baza unei măsurători inițiale, care poate fi sau nu reprezentativă pentru eșantionul adevărat.

Aceasta are ca rezultat o eficiență îmbunătățită a colectării datelor fără intervenția utilizatorului și, prin urmare, măsurătorile eșantioanelor stabile care necesită colectarea mai puține date pot fi finalizate într-un timp mai scurt, în timp ce pentru eșantioanele complexe care prezintă un anumit nivel de incertitudine se va colecta automat o cantitate mai mare de date pentru a obține un rezultat cu o încredere comparabilă.

Optimizarea eșantionării

După cum s-a descris în secțiunea 2.2, există mai multe surse de zgomot în funcția de corelație, iar amplitudinea acestui zgomot poate fi dependentă de timp. Deși în secțiunea 2.2 s-a argumentat în favoarea utilizării unor timpi de corelație scurți, există cazuri în care acest lucru poate fi dăunător.

Pentru un eșantion care prezintă proprietăți de împrăștiere scăzute, fie printr-o secțiune transversală de împrăștiere mică, fie printr-o concentrație scăzută a eșantionului, fie printr-o diferență mică a indicelui de refracție față de dispersantul înconjurător sau printr-o combinație a acestora, este posibil să existe mai puțini fotoni detectați care să populeze intervalele de timp ale corelatorului, iar acest lucru se va manifesta în mod obișnuit ca zgomot în linia de bază a funcției de corelație la timpi de întârziere mai lungi ai corelatorului, τ.

Instrumentele comerciale de împrăștiere a luminii variază, de obicei, o serie de setări instrumentale ca parte a procedurii de configurare a măsurătorilor, cum ar fi optimizarea poziției de măsurare în interiorul cuvei pentru a minimiza lungimea traseului optic al laserului de intrare și a traseului de detectare a împrăștierii de ieșire pentru a evita împrăștierea multiplă de la probele concentrate în apropierea centrului cuvei sau, invers, pentru a evita împrăștierea statică de la peretele celular la concentrații scăzute ale probei și optimizarea ratei de numărare a fotonilor detectați pentru a rămâne în intervalul liniar al detectorului. Aceste optimizări instrumentale sunt, în general, concepute pentru a permite utilizatorilor care nu sunt familiarizați cu interpretarea datelor de împrăștiere a luminii să obțină cele mai fiabile rezultate într-o gamă largă de concentrații și dimensiuni ale probelor, dar o astfel de optimizare nu a fost aplicată anterior timpului de corelație. Un exemplu în acest sens este prezentat în Fig. 4b, cu distribuțiile dimensiunilor particulelor prezentate pentru o probă de 1,0 mg/mL de lizozimă măsurată la un unghi de detecție de 90°. PSD raportată pentru un timp de corelație scurt arată o componentă aparent de dimensiuni mari în plus față de vârful principal al particulelor). Dacă acesta ar fi fost un efect real al eșantionului, măsurătorile la un unghi de detecție mai mic ar fi arătat aceeași componentă mare. Măsurătorile de împrăștiere înainte pentru același eșantion au fost monomodale (a se vedea SI), iar absența vârfului la în datele măsurate la alte unghiuri de detecție (Informații suplimentare) indică faptul că acesta s-ar fi putut datora unei combinații de eșantion cu dispersie redusă și dispersie statică, posibil, de la cuva de probă de unică folosință. În timp ce intensitatea luminii incidente poate fi optimizată, unele eșantioane, cum ar fi proteinele cu concentrație scăzută, pot împrăștia un număr sub optim de fotoni chiar și fără atenuarea laserului de iluminare, ceea ce înseamnă că procesele de operare standard pentru un sistem comercial de împrăștiere dinamică a luminii pot să nu fie optime și că pot fi utilizați timpi de corelație mai lungi24 , fiind necesară dezvoltarea unei metode extinse pentru a determina aceste setări. Prin urmare, se poate introduce o altă adaptare a măsurării, determinată de eșantion, prin care instrumentul utilizează cea mai scurtă lungime de sub-măsurare posibilă care va produce un număr optim de fotoni de măsurat (a se vedea SI) și aceasta este descrisă în schema de măsurare optimizată din secțiunea următoare.

Schema de măsurare optimă

Schema de măsurare optimă este alcătuită din următorul proces:

(1)
Optimizarea poziției de măsurare și a intensității luminii incidente.
(2)
Dacă nivelul de împrăștiere detectat este scăzut chiar și cu cea mai mică atenuare a laserului, se optimizează lungimea de sub-măsurare pentru a reduce zgomotul liniei de bază.
(3)
Submăsurătorile sunt adunate și analizate cu ajutorul analizei cumulanților.
(4)
Valorile PdI din aceste analize sunt comparate și valorile aberante sunt identificate.
(5)
Se calculează media funcțiilor de corelație ale sub-măsurărilor în stare de echilibru, iar rezultatul este analizat pentru a raporta un ZAve.
(6)
Se înregistrează și se analizează mai multe sub-măsurări ca mai sus și se înregistrează un nou răspuns final ZAve.
(7)
Acest proces se repetă până când se constată că cele două rezultate ZAve anterioare de la etapele (5) și (6) sunt în concordanță cu ajutorul unui test de ipoteză.
(8)
Toate sub măsurătorile tranzitorii sunt, de asemenea, mediate și analizate pentru a furniza informații despre componenta tranzitorie.

Datorită răspunsului algoritmului de mai sus la caracteristicile eșantionului, lungimea sub-măsurării, cantitatea de date colectate și sub-măsurătorile care trebuie omise din rezultatul staționar depinzând toate de calitatea eșantionului și a datelor, metoda este supranumită corelație adaptivă, inspirându-se din utilizarea opticii adaptive în astronomie31, unde feedback-ul datelor este utilizat pentru a corecta aberațiile observate.

Universe