Identificarea și caracterizarea unei noi neurotoxine botulinice

Cercetarea bazelor de date genomice a dezvăluit o nouă genă BoNT

În încercarea de a studia peisajul evolutiv al BoNT-urilor, am efectuat căutări iterative cu modelul Hidden Markov în baza de date de secvențe Uniprot. Căutarea noastră a identificat toate subtipurile cunoscute de BoNT și toxinele mozaic, precum și neurotoxina tetanică înrudită (Fig. 1a; Fig. Suplimentară 1). Spre surprinderea noastră, căutarea a evidențiat o BoNT potențial nouă, desemnată provizoriu BoNT/X (Fig. 1a, nr. GenBank: BAQ12790.1), din secvența genomică recent raportată a tulpinii 111 de C. botulinum. BoNT/X a prezentat cea mai mică identitate de secvență proteică cu celelalte BoNT-uri în comparațiile pe perechi (Fig. 1b). În plus, similitudinea redusă a secvenței este distribuită uniform de-a lungul întregii secvențe BoNT/X (Fig. 1c), ceea ce indică faptul că nu este o toxină mozaic. În ciuda acestei identități scăzute de secvență, aranjamentul general al domeniilor BoNT-urilor este conservat în BoNT/X (Fig. 1c), inclusiv un motiv de protează dependentă de zinc HEXXH (reziduurile 227-231, HELVH) în LC (ref. 33) și un motiv SXWY în HC (reziduurile 1,274-1,277, SAWY), care recunoaște gangliozidele receptorilor lipidici34.

(a) O rețea de divizare filogenetică care acoperă toate serotipurile, subtipurile, toxinele mozaic și neurotoxina tetanică (TeNT) înrudite BoNT ilustrează potențialele relații evolutive ale acestora, precum și conflictele care decurg, de exemplu, din chimerisme, pe baza secvențelor lor proteice. BoNT/X este evidențiată cu roșu. O versiune mărită a acestui panou este prezentată în figura suplimentară 1, cu numărul de acces la secvență pentru fiecare genă de toxină menționat. (b) Un arbore filogenic al alinierii secvențelor proteice pentru BoNT/A-G, TeNT și BoNT/X, analizat prin metoda ClustalW. Sunt notate procentele de identitate de secvență între fiecare toxină și BoNT/X. (c) Panoul superior: un desen schematic al celor trei domenii ale BoNT/X, cu motivul conservat de protează din LC și motivul de legare a gangliozidelor din HC. Panoul inferior: analiza folosind o fereastră glisantă de comparație a secvenței a demonstrat că similitudinea scăzută dintre BoNT/X și alte BoNT/TeNT este distribuită uniform de-a lungul întregii secvențe BoNT/X. Axa X reprezintă poziția secvenței de interogare în centrul unei ferestre de comparare a secvențelor mobile de 100 de aminoacizi. Axa Y arată procentajul de identitate dintre această fereastră de secvență și fiecare dintre secvențele de fond aliniate. Cele două bare din partea superioară a graficului ilustrează cea mai bună secvență de potrivire (bara inferioară) și dacă cea mai bună potrivire este semnificativ separată de cea de-a doua cea mai bună potrivire (bara superioară). (d) Un desen schematic al clusterului de gene orf care găzduiește gena BoNT/X (panoul superior), care are două caracteristici distincte în comparație cu alte clustere orfX cunoscute (panourile din mijloc și inferior): (1) există o proteină orfX2 suplimentară (denumită orfX2b) localizată lângă gena BoNT/X; (2) cadrul de citire al genelor orfX are aceeași direcție ca și gena BoNT/X.

Similară celorlalte BoNT, gena BoNT/X este localizată într-un cluster de gene23. Toate cele șapte BoNT stabilite sunt coexprimate împreună cu o altă proteină de 150 kDa cunoscută sub numele de NTNHA (proteină non-toxică nehemaglutinină), care formează un complex dependent de pH cu BoNT și le protejează de proteaze în tractul gastrointestinal35. Gena BoNT/X este, de asemenea, precedată de o potențială genă NTNHA (Fig. 1d). În afară de BoNT și NTNHA, un grup tipic de gene BoNT conține gene care codifică unul dintre cele două tipuri de proteine accesorii: (1) clusterul HA care codifică trei proteine conservate HA17, HA33 și HA70, care formează un complex cu BoNT/NTNHA și facilitează absorbția toxinelor prin bariera epitelială intestinală36,37,38; sau (2) clusterul OrfX care codifică proteinele conservate OrfX1, OrfX2, OrfX3 și P47 cu funcție necunoscută23. Gena BoNT/X este localizată într-un cluster de gene OrfX, la fel ca și BoNT/E, F și membrii BoNT/A. În mod interesant, clusterul BoNT/X are două caracteristici unice (Fig. 1d): (1) există o genă OrfX2 suplimentară care nu există în niciun alt cluster BoNT (am numit-o OrfX2b); (2) cadrul de citire al genelor OrfX este, de obicei, opus genelor BoNT/NTNHA, dar are aceeași direcție ca și gena BoNT/X din clusterul BoNT/X (Fig. 1d). Aceste constatări sugerează că BoNT/X este o ramură unică a familiei BoNT.

CLC a BoNT/X clivează VAMP2 într-un loc nou

Pentru a caracteriza BoNT/X, ne-am concentrat mai întâi asupra LC sale (X-LC, reziduurile 1-439) și am produs-o ca proteină marcată His6 în Escherichia coli. LC ale BoNT/A (A-LC) și BoNT/B (B-LC) au fost produse și analizate în paralel ca martori. Incubarea X-LC cu extracte de detergent din creier de șobolan (BDE) nu a afectat sintaxina 1 sau SNAP-25, dar a abolit semnalele imunoblot VAMP2 (Fig. 2a). LC ale BoNT-urilor sunt proteaze dependente de zinc33. Așa cum era de așteptat, EDTA a împiedicat scindarea proteinelor SNARE de către X-, A- și B-LCs (Fig. 2a). Mai mult, incubarea X-LC cu domeniul citosolic recombinant purificat al VAMP2 (reziduurile 1-93) a transformat VAMP2 în două benzi cu greutate moleculară mai mică (Fig. 2b), confirmând faptul că X-LC clivează VAMP2.

(a) X-LC a fost incubat cu BDE. S-a efectuat o analiză imunoblot pentru a detecta sintaxina 1, SNAP-25 și VAMP2. Sinaptofizina (Syp) a servit drept control de încărcare. A-LC și B-LC au fost analizate în paralel. Scindarea VAMP2 de către B-LC duce la pierderea semnalelor imunoblot, în timp ce scindarea SNAP-25 de către A-LC generează un fragment mai mic (marcat cu un asterisc). EDTA a blocat activitatea X-, A- și B-LCs. (b) VAMP2 (1-93) a fost incubat cu X-LC. Probele au fost analizate prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie. X-LC a transformat VAMP2 (1-93) în două fragmente mai mici. (c-e) VAMP2 (1-93) a fost incubat cu X-LC. Probele au fost analizate prin spectrometrie de masă (LC-MS/MS) pentru a determina greutatea moleculară a fragmentelor scindate. Vârfurile peptidelor eluate din coloana HPLC sunt reprezentate grafic în funcție de timpul de funcționare (RT, axa X). Datele de spectrometrie de masă pentru cei doi produși de scindare sunt codificate în culori, cu indicarea raportului masă-încărcare (m/z). Greutatea moleculară este dedusă prin înmulțirea lui m cu z, urmată de scăderea lui z. Secvențele proteice pentru cei doi produși de scindare sunt codificate în culori și enumerate în c. (f) Alinierea secvențelor între membrii familiei VAMP, cu situsurile de scindare pentru BoNT/B, D, F, G și X marcate cu roșu, iar cele două motive SNARE sunt marcate în nuanță albastră. (g) VAMP1, 3, 7 și 8 marcate cu HA și Sec22b și Ykt6 marcate cu Myc au fost exprimate în celule 293T prin transfecție tranzitorie. Lizații celulare au fost incubate cu X-LC și supuse analizei imunoblot. Actina este un control de încărcare. (h) Ykt6 marcat cu GST a fost incubat cu X-LC (100 nM). Probele au fost analizate prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie. (i) VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) și VAMP5 (1-70) marcate cu GST au fost incubate cu X-LC (100 nM). Probele au fost analizate prin SDS-PAGE și colorare cu Coomassie Blue. X-LC a scindat atât VAMP4, cât și VAMP5. Observăm că proteina VAMP5 conține o bandă contaminantă care se află aproape de produsul de clivaj. (j) Experimentele au fost efectuate conform descrierii de la punctul a, cu excepția faptului că VAMP4 și Sec22b au fost detectate. Sinaptotagmina I (Syt I) este un control de încărcare. X-LC a scindat VAMP4 nativ în BDE. Este prezentat unul din două (b,g,j) sau trei (a,h,i) experimente independente.

Pentru a identifica locul de clivaj, am analizat proteina VAMP2 (1-93), cu sau fără pre-incubare cu X-LC, prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă în tandem (LC-MS/MS, Fig. 2c-e). Un singur vârf peptidic dominant a apărut după incubarea cu X-LC (Fig. 2c,e; Fig. suplimentară 2). Greutatea sa moleculară este de 3.081,7, care se potrivește doar cu secvența peptidică A67-L93 a VAMP2 (Fig. 2c,e). În mod consecvent, a fost detectat, de asemenea, un alt fragment de la începutul etichetei His6 până la reziduul R66 din VAMP2 (Fig. 2d). Pentru a confirma în continuare această constatare, am repetat testul cu un fragment diferit de VAMP2: VAMP2 marcat cu glutation S-transferază (GST) (33-86) (Fig. suplimentară 3). Incubarea cu X-LC a generat un singur vârf peptidic dominant cu o greutate moleculară de 2.063,1, care se potrivește doar cu A67-R86 din VAMP2 (Fig. suplimentară 3). Împreună, aceste rezultate demonstrează că X-LC are un singur situs de clivaj pe VAMP2 între R66 și A67.

R66-A67 este un nou situs de clivaj pe VAMP2, diferit de toate situsurile țintă stabilite ale BoNT-urilor (Fig. 2f). Este, de asemenea, singurul situs de clivaj BoNT localizat în cadrul unei regiuni cunoscute anterior ca motiv SNARE (Fig. 2f, regiuni umbrite)39. Familia de proteine VAMP include proteinele VAMP1, 2, 3, 3, 4, 5, 7 și 8, precum și Sec22b și Ykt6, înrudite. R66-A67 este conservată în VAMP1 și 3, care sunt foarte asemănătoare cu VAMP2. Pentru a valida specificitatea X-LC, am exprimat VAMP1, 3, 7, 8 marcate cu HA și Sec22b și Ykt6 marcate cu Myc în celule HEK293 prin transfecție tranzitorie. Lizații celulare au fost incubați cu X-LC. Atât VAMP1 cât și 3 au fost scindate de X-LC, în timp ce VAMP7, VAMP8 și Sec22b au fost rezistente la X-LC (Fig. 2g).

BoNT/X scindează VAMP4, VAMP5 și Ykt6

În mod neașteptat, Ykt6 a fost, de asemenea, scindat de X-LC (Fig. 2g). Această constatare a fost confirmată cu ajutorul unui fragment purificat de Ykt6 marcat cu GST, care s-a deplasat către o bandă cu greutate moleculară mai mică după incubarea cu X-LC (Fig. 2h). S-a stabilit că situsul de scindare este K173-S174 prin analiza prin spectrometrie de masă a Ykt6 intact față de Ykt6 scindat de X-LC (figura suplimentară 4). Acest situs este omogen cu situsul de clivaj al BoNT/X pe VAMP2 (Fig. 2f). Dintre proteinele din familia VAMP, VAMP4 conține aceeași pereche de reziduuri (K87-S88) în acest loc ca și Ykt6. Am constatat că X-LC a scindat atât domeniul citoplasmatic purificat GST-tagged al VAMP4 (Fig. 2i), cât și VAMP4 nativ în BDE (Fig. 2j). Ca un control, Sec22b nu a fost scindat de X-LC în BDE. În plus, domeniul citoplasmatic marcat cu GST al VAMP5 a fost, de asemenea, scindat (Fig. 2i). Locurile de clivaj au fost determinate prin analiza prin spectrometrie de masă ca fiind K87-S88 în VAMP4 și R40-S41 în VAMP5 (Fig. Suplimentară 5). Ambele situsuri sunt omoloage cu situsul de clivaj al BoNT/X de pe VAMP2 (Fig. 2f), demonstrând că locația situsului de clivaj este conservată la diferite VAMP-uri. Capacitatea X-LC de a cliva VAMP4, VAMP5 și Ykt6 este foarte neobișnuită, deoarece secvențele lor sunt substanțial diferite de VAMP1/2/3. BoNT/X este primul și singurul BoNT cunoscut care poate scinda VAMP-uri dincolo de țintele canonice VAMP1, 2 și 3 (ref. 40).

Activarea proteolitică a BoNT/X

Am examinat în continuare regiunea de legătură dintre LC și HC, care trebuie scindată de proteazele bacteriene sau ale gazdei pentru a transforma toxina într-o formă „activă” de catenă dublă. Am produs un fragment X-LC-HN recombinant (reziduurile 1-891) în E. coli și l-am supus la o proteoliză limitată de către endoproteinaza Lys-C. Probele au fost analizate cu ajutorul etichetării Tandem Mass Tag (TMT) și al spectrometriei de masă în tandem. TMT marchează terminațiile N-terminale libere (și lizinele). Proteoliza limitată de către Lys-C a produs o nouă terminație N liberă cartografiată la reziduul N439 din regiunea de legătură (Fig. 3a; Date suplimentare 1), confirmând că regiunea de legătură este sensibilă la proteaze.

(a) Alinierea secvenței de legătură dintre LC și HC a celor șapte BoNT-uri stabilite plus BoNT/X. Situl de tăiere Lys-C a fost identificat prin analiza prin spectrometrie de masă (a se vedea metoda și datele suplimentare 1). (b) Neuronii corticali de șobolan în cultură au fost expuși la X-LC-HN timp de 12 h. Lizații celulare au fost recoltați și s-a efectuat o analiză imunoblot pentru a examina sintaxina 1, SNAP-25 și VAMP2. Actina este un control de încărcare. A-LC-HN activată cu tripsină și B-LC-HN activată cu tripsină au fost analizate în paralel. X-LC-HN a intrat în neuroni și a scindat VAMP2. X-LC-HN activată de Lys-C a prezentat o potență mai mare decât X-LC-HN neactivată. X-LC-HN a fost mai puternic decât B-LC-HN și A-LC-HN, niciunul dintre acestea nu și-a scindat substraturile. (c) X-LC-HN WT și X-LC-HN mutant au fost activate de Lys-C și analizate prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie, cu sau fără DTT. Mutanții C461S și C467S au apărut ca o singură bandă de ∼100 kDa fără DTT și s-au separat în două benzi de ∼50 kDa cu DTT. O parte din WT X-LC-HN a format agregate, marcate cu un asterisc, care au dispărut cu DTT. Majoritatea X-LC-HN WT X-LC-HN activate s-au separat în două benzi de ∼50 kDa fără DTT. Acest lucru se datorează amestecării legăturilor disulfidice, așa cum este descris în panoul următor. (d) Lys-C-activat WT X-LC-HN WT a fost incubat cu NEM pentru a bloca amestecarea legăturilor disulfidice. Probele au fost apoi analizate prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie. Majoritatea WT X-LC-HN există ca o singură bandă la ∼100 kDa fără DTT după tratamentul cu NEM, ceea ce indică faptul că WT X-LC-HN nativ conține o legătură disulfură între lanțuri. (e) Desene schematice ale legăturii disulfidice în WT și în trei mutanți de cisteină ai BoNT/X. (f) Experimentele au fost efectuate conform descrierii de la punctul b, cu excepția faptului că neuronii au fost expuși la WT sau la mutanții X-LC-HN. Mutația C423S a abolit activitatea X-LC-HN, în timp ce mutația C461 sau C467 nu a afectat activitatea X-LC-HN. Aceste rezultate au confirmat faptul că legătura disulfură între lanțuri este esențială pentru activitatea X-LC-HN, iar această legătură disulfură între lanțuri poate fi formată fie prin C423-C461, fie prin C423-C467. Este prezentat unul din două (b) sau trei (b,c,f) experimente independente.

Apoi am examinat dacă activarea proteolitică sporește potența BoNT/X. S-a demonstrat că incubarea unor concentrații mari de LC-HN de BoNT cu neuronii cultivați are ca rezultat intrarea LC-HN, probabil prin absorbție nespecifică în neuroni41. În mod similar, X-LC-HN a intrat în neuronii corticali de șobolan cultivați și a scindat VAMP2 într-o manieră dependentă de concentrație (Fig. 3b). Activarea prin Lys-C a crescut potența X-LC-HN: 10 nM de X-LC-HN activat a scindat niveluri similare de VAMP2 ca 150 nM de X-LC-HN intact (Fig. 3b). X-LC-HN activată pare a fi mai puternică decât LC-HN activată a BoNT/A (A-LC-HN) și BoNT/B (B-LC-HN), care nu au prezentat nicio scindare detectabilă a substraturilor lor în aceleași condiții de testare (Fig. 3b).

Legătura disulfidică între lanțuri în BoNT/X

Ca și alte BoNT-uri, regiunea de legătură a BoNT/X conține două cisteine conservate, dar există și o cisteină suplimentară (C461) unică pentru BoNT/X (Fig. 3a). Pentru a determina reziduurile de cisteină care formează legătura disulfură esențială între lanțuri, am generat trei mutanți X-LC-HN, fiecare cu unul dintre cele trei reziduuri de cisteină mutate (C423S, C461S și C467S). Acești mutanți, precum și X-LC-HN de tip sălbatic (WT), au fost supuși unei proteolize limitate cu Lys-C și apoi analizați prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie, cu sau fără agentul reducător ditiotreitol (DTT; Fig. 3c). Se așteaptă ca mutarea singurei cisteine de pe LC (C423S) să elimine legătura disulfidică între lanțuri. În mod consecvent, mutantul C423S s-a separat în două benzi de ∼50 kDa fără DTT. În schimb, ambii mutanți C461S și C467S au arătat ca o singură bandă de 100 kDa în absența DTT și s-au separat în două benzi ∼50 kDa în prezența DTT. Aceste rezultate au sugerat că C423 de pe LC poate forma legătura disulfură între lanțuri fie cu C461, fie cu C467 de pe HC. Am constatat, de asemenea, că tratamentul cu Lys-C a degradat o parte semnificativă a mutantului C423S în comparație cu mutanții C461S sau C467S (Fig. 3c, +DTT), sugerând că pierderea legăturii disulfidice inter-catenară face ca molecula să fie mai sensibilă la proteaze. Am observat că o parte din X-LC-HN WT a format agregate în partea superioară a gelului SDS-PAGE (Fig. 3c, marcată cu un asterisc). Aceste agregate au dispărut în prezența DTT. C423/C461/C467 sunt singurele trei cisteine din X-LC-HN; mutarea oricăreia dintre ele a abolit formarea agregatelor (Fig. 3c, -DTT), sugerând că aceste agregate sunt formate de legături disulfidice intermoleculare datorită existenței unei cisteine suplimentare în regiunea de legătură.

În mod interesant, majoritatea X-LC-HN activat WT s-a separat în două benzi ∼50 kDa fără DTT (Fig. 3c), ceea ce este similar cu mutantul C423S. Pe de altă parte, WT X-LC-HN nu a prezentat o degradare crescută de Lys-C în comparație cu mutantul C423S (Fig. 3c, +DTT). O posibilă explicație este că WT X-LC-HN conține o legătură disulfidică între lanțuri în condiții native, dar această legătură se poate rearanja în pereche C461-C467 în interiorul lanțului în condiții de denaturare în tamponul SDS. Acest fenomen este cunoscut sub numele de shuffling al legăturii disulfidice, care apare adesea între cisteinele adiacente. Pentru a testa această ipoteză, am utilizat un reactiv de alchilare, N-etilmaleimida (NEM), care blochează permanent cisteinele libere și previne amestecarea legăturilor disulfidice. După cum se arată în Fig. 3d, WT X-LC-HN pretratat cu NEM a apărut ca o singură bandă la 100 kDa în absența DTT și s-a separat în două benzi ∼50 kDa în prezența DTT. Aceste rezultate confirmă faptul că WT X-LC-HN conține în principal o legătură disulfidică între lanțuri, dar este susceptibilă la amestecarea legăturilor disulfidice din cauza unei cisteine suplimentare în regiunea de legătură (Fig. 3e).

Am examinat în continuare activitatea celor trei mutanți de cisteină X-LC-HN pe neuronii cultivați. După cum era de așteptat, mutantul C423S a fost inactiv, în timp ce mutanții C461S și C467S au prezentat ambii niveluri de activitate similare cu cele ale mutantului WT X-LC-HN (Fig. 3f). Aceste rezultate confirmă faptul că legătura disulfidică între lanțuri este esențială pentru activitatea BoNT/X.

Generarea BoNT/X de lungime completă prin ligatura mediată de sortază

Am încercat apoi să determinăm dacă BoNT/X de lungime completă este o toxină funcțională. Deoarece nu sunt disponibili antiseruri împotriva BoNT/X, am decis să evităm generarea genei toxinei active de lungime completă. În schimb, am dezvoltat o abordare pentru a genera o cantitate limitată de BoNT de lungime completă în eprubete prin ligatura enzimatică a două fragmente netoxice de BoNT. Această metodă utilizează o transpeptidază cunoscută sub numele de sortază42,43, care recunoaște motivul peptidic LPXTG, clivează între T-G și formează concomitent o nouă legătură peptidică cu alte proteine/peptide care conțin glicină N-terminală (Fig. 4a). Am produs două fragmente netoxice de BoNT/X: (1) LC-HN cu un motiv LPETGG și o etichetă His6 fuzionată la terminalul C; și (2) HC de BoNT/X (X-HC) cu o etichetă GST, un situs de clivaj al trombinei și un reziduu suplimentar de glicină la terminalul N. Tăierea prin trombină eliberează X-HC cu o glicină liberă la terminația sa N. Incubarea acestor două fragmente cu sortază a generat o cantitate mică de ∼150 kD BoNT/X de lungime completă (X-FL, Fig. 4a,b). Observăm că X-HC a prezentat o solubilitate slabă și o tendință puternică de agregare, ceea ce ar putea fi motivul pentru eficiența scăzută a ligării (Fig. 4b). În schimb, legarea X-LC-HN cu HC de BoNT/A (A-HC) a obținut o eficiență mai bună, majoritatea X-LC-HN fiind ligaturată într-o toxină chimeră XA (Fig. suplimentară 6a). Pentru a asigura biosecuritatea, cantitatea de fragmente precursoare din reacție este strict limitată pentru a genera cantitatea minimă de toxină ligată necesară pentru testele funcționale.

(a) Un desen schematic al metodei de ligare cu sortază. (b) Amestecurile de reacție de ligare a sortazei au fost analizate prin SDS-PAGE și colorare cu albastru Coomassie. Asteriscul marchează agregatele proteice datorate legăturilor disulfidice intermoleculare. BoNT/X de lungime completă (X-FL) a apărut numai în amestecul de ligare cu sortază. (c) Neuronii expuși la amestecul de ligare a sortazei (15 μl) sau la amestecuri de control timp de 12 h în mediu de cultură. Lizații celulare au fost analizate prin imunoblot. Amestecul care conține atât X-LC-HN, cât și X-HC (dar nu și sortază) a scindat puțin mai mult VAMP2 decât X-LC-HN singur. Ligaturarea X-LC-HN și X-HC cu triază a sporit și mai mult scindarea VAMP2, demonstrând că X-FL ligat este funcțional pe neuroni. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC și BoNT/X au fost supuse testului dot blot, folosind patru antiseruri de cal (anti-BoNT/A, B și E trivalente, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC și anti-BoNT/F), precum și două antiseruri de capră (anti-BoNT/G și anti-BoNT/D). BoNT/X este compus din X-LC-HN și X-HC în raport molar 1:1. Acești antiseruri au recunoscut toxinele țintă corespunzătoare, însă niciunul nu a recunoscut BoNT/X. Antiserurile împotriva BoNT/DC și BoNT/C reacționează încrucișat, deoarece aceste două toxine au un grad ridicat de similitudine în cadrul domeniilor lor HC. (e) Neuronii corticali de șobolan în cultură au fost expuși la X-FL ligaturat în mediu de cultură timp de 12 ore, cu sau fără două combinații de antiseruri. Ab1: anti-BoNT/A/B/E trivalent, anti-BoNT/C și anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G și anti-BoNT/D. Anti-BoNT/A/B/E trivalent a fost utilizat la o diluție de 1:50. Toate celelalte antiseruri au fost utilizate la o diluție de 1:100. Niciunul dintre antiseruri nu a afectat scindarea VAMP2 și VAMP4 de către X-FL. Specificitatea și potența acestor antiseruri au fost validate în ceea ce privește capacitatea lor de a neutraliza serotipurile țintă în același test descris în figura suplimentară 7. (f) X-FL legat prin reacție de sortare (0,5 μg) a fost injectat în mușchii gastrocnemieni ai membrului posterior drept al șoarecilor (n=4). Membrul injectat a dezvoltat o paralizie flaccidă tipică, iar degetele de la picioare nu au reușit să se extindă în decurs de 12 h. Membrul stâng nu a fost injectat cu toxine, servind drept martor. (g) Forma inactivă de lungime completă a BoNT/X (BoNT/XRY) a fost purificată ca proteină recombinantă marcată His6 în E. coli. BoNT/XRY purificată în continuare este prezentată în figura suplimentară 8b. Este prezentat unul din două (e) sau trei (c,d) experimente independente.

Am analizat mai întâi activitatea BoNT/X ligat folosind neuroni corticali de șobolan cultivați. Neuronii au fost expuși la amestecul de ligaturare a triazei și la amestecuri de control în mediul de cultură. După cum se arată în Fig. 4c, X-LC-HN singur a scindat o parte din VAMP2 datorită concentrației sale ridicate în amestecul de reacție. Amestecarea X-HC cu X-LC-HN fără triază a îmbunătățit ușor scindarea VAMP2 în comparație cu X-LC-HN singur, sugerând că X-HC ar putea fi asociat cu X-LC-HN prin interacțiuni necovalente. Această interacțiune pare a fi specifică, deoarece amestecarea A-HC cu X-LC-HN nu a îmbunătățit scindarea VAMP2 în neuroni (Fig. suplimentară 6b). Ligaturarea X-LC-HN cu X-HC prin triază a sporit în mod clar clivarea VAMP2 în comparație cu amestecul de X-LC-HN și X-HC fără triază (Fig. 4c). Aceste rezultate au demonstrat că X-HC este funcțional pentru direcționarea celulelor și că BoNT/X ligaturat de lungime completă a intrat în neuroni și a scindat VAMP2. În mod similar, XA legat a intrat, de asemenea, în neuroni și a scindat VAMP2 (Fig. suplimentară 6b).

BoNT/X nu a fost recunoscut de antiserurile împotriva BoNT-urilor cunoscute

Am efectuat în continuare teste dot blot folosind antiseruri crescute împotriva BoNT-urilor cunoscute, incluzând toate cele șapte serotipuri, precum și o toxină mozaic (BoNT/DC), pentru a confirma faptul că BoNT/X este unic din punct de vedere serologic. S-au utilizat patru antiseruri de cal (anti-BoNT/A, B și E trivalente, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC și anti-BoNT/F), precum și două antiseruri de capră (anti-BoNT/G și anti-BoNT/D). Specificitatea și potența acestor antiseruri au fost validate mai întâi prin analizarea capacității lor de a neutraliza BoNT pe neuronii cultivați. Așa cum era de așteptat, toți antiserurile au neutralizat BoNT-urile lor țintă, fără a afecta activitatea unui serotip diferit (figura suplimentară 7). Am constatat că acești antiseruri au recunoscut BoNT-urile lor corespunzătoare în testul dot blot, însă niciunul nu a recunoscut BoNT/X (Fig. 4d).

Am analizat în continuare dacă toxicitatea BoNT/X asupra neuronilor poate fi neutralizată de acești antiseruri. X-FL generată prin ligatura mediată de triază a fost mai întâi activată cu proteoliză limitată cu tripsină. Am folosit tripsina pentru a activa X-FL în loc de Lys-C pentru testele funcționale, deoarece tripsina ne permite să oprim proteoliza cu ajutorul inhibitorilor de tripsină. X-FL activat a intrat în neuronii corticali de șobolan cultivați și a scindat atât VAMP2, cât și VAMP4 într-o manieră dependentă de concentrație (Fig. 4e). Combinațiile de antiseruri împotriva BoNT-urilor cunoscute [Ab1 (antiseruri de cal): anti-BoNT/A, B și E trivalent, anti-BoNT/C și anti-BoNT/F; Ab2 (antiseruri de capră): anti-BoNT/G și anti-BoNT/D] nu au afectat activitatea X-FL-ului legat, așa cum reiese din gradele similare de scindare a VAMP2 și VAMP4 în prezența acestor antiseruri (Fig. 4e). Aceste rezultate au confirmat faptul că BoNT/X este un nou serotip BoNT.

BoNT/X a indus paralizie flască in vivo la șoareci

Am încercat apoi să determinăm dacă BoNT/X este activ in vivo folosind un test non-letal bine stabilit la șoareci, cunoscut sub numele de testul Digit Abduction Score (DAS), care măsoară paralizia musculară locală în urma injecției de BoNT în mușchii membrelor posterioare ale șoarecilor44. BoNT-urile provoacă paralizia flască a mușchilor membrelor, care se manifestă prin incapacitatea de a depărta degetele de la picioare ca răspuns la un stimul de tresărire. Am injectat X-FL ligaturat (0,5 μg, activat prin tratament cu tripsină) în mușchii gastrocnemieni ai membrului posterior drept la șoareci, ceea ce a indus o paralizie flască tipică și eșecul de a întinde degetele de la picioare (Fig. 4f), ceea ce indică faptul că BoNT/X este capabil să provoace paralizie flască in vivo. Observăm că potența X-FL ligaturat pare să fie mult mai mică decât a altor BoNT în acest test. Pentru a confirma în continuare toxicitatea scăzută a X-FL legat, am injectat șoareci cu 1 μg de X-FL legat intraperitoneal (n=3). Niciun șoarece nu a prezentat efecte sistemice și toți au supraviețuit la această doză. Astfel, X-FL ligaturat are o toxicitate destul de scăzută in vivo la șoareci în comparație cu alte BoNT native, care au de obicei doze letale la niveluri scăzute de picograme pe șoarece.

BoNT/X inactiv de lungime completă

În cele din urmă, am dezvoltat un mutant inactiv al BoNT/X ca un potențial reactiv pentru generarea de anticorpi neutralizanți. Mutațiile la două reziduuri (R362A/Y365F) din BoNT/A inactivează activitatea proteazică a LC și anulează toxicitatea BoNT/A in vivo45,46. Aceste două reziduuri sunt conservate în BoNT/X. Am introdus mutațiile corespunzătoare (R360A/Y363F) în BoNT/X și am generat o formă inactivă de lungime completă, denumită BoNT/XRY. După cum se arată în Fig. 4g, BoNT/XRY a fost purificată ca proteină marcată His6 în E. coli și nu a avut nicio activitate asupra neuronilor cultivați (Fig. suplimentară 8a). Mai mult, injectarea intraperitoneală a șoarecilor cu 30 μg BoNT/XRY (activată prin tratament cu tripsină) nu a provocat niciun efect advers (n=5), demonstrând că nu este toxică in vivo. O porțiune substanțială de BoNT/XRY a format agregate în partea superioară a gelului SDS-PAGE (Fig. 4g). Adăugarea de DTT a redus aceste agregate la BoNT/XRY monomeric (Fig. 4g). Astfel, BoNT/X de lungime completă este susceptibil să formeze legături disulfidice intermoleculare. Cu toate acestea, forma monomerică a BoNT/X poate fi purificată și este stabilă în soluție (Fig. 4g). Mai mult, am dezvoltat un protocol de purificare la scară mare, care a generat BoNT/XRY cu un randament de ∼3 mg pe litru de cultură și o puritate de ∼90% (Fig. suplimentară 8b). BoNT/XRY înalt purificat a rămas stabil în soluție până la 10 mg ml-1 în prezența unui agent reducător. Acest BoNT/XRY atoxic va fi un reactiv valoros pentru generarea de anticorpi neutralizanți.

.